별첨 1

◎ 형 태 : 크기는 약 33~37mm 정도의 크기로 몸의 색은 진한 갈색으로 불규칙한 흰색의 얼룩무늬가 곳곳에 나타나 있으며, 머리는 작고 머리방패는 긴사각형으로 앞가두리는 넓고 위로 젖혀져 있으며, 회백색과 황백색의 짧은 털이 촘촘히 나타나 있다. 촉각은 10마디로 수컷의 곤봉부는 7마디로서 매우 길고 굽어 있으며 암컷은 5~6마디로 직선형이다. 앞가슴 등판은 짧고 넓으며 흰색의 짧은 털이 있고 뒷가두리의 아래쪽에 연한 노란색의 짧은 털이 촘촘히 있다. 딱지날개는 타원형으로 분명하지 않은 3줄의 세로로 솟아오른 부분을 찾아볼 수 있다. 수컷의 앞다리 종아리마디에는 2개의 가시돌기가 있고, 암컷에는 3개의 가시돌기가 있다.

◎ 생 태 : 평지의 경작지 주변의 풀밭에서 살아가고 있으며 늦은 봄부터 가을까지 찾아볼 수 있다. 특히 6~7월에 개체수가 많아지고, 주로 파꽃에 무리를 지어 모이기도 하며 불빛에 날아든다. 유충은 갈대 따위의 하천변 식물이 퇴적한 곳에 사는 것으로 알려져 있으며, 소나무류, 사시나무류, 갈참나무, 참나무 등의 뿌리를 갉아먹는다. 강변이나 하천가의 환경 개조로 인하여 서식처가 없어져 개체수가 급격히 감소하고 있다.

가) 대상종 및 시료확보 상황

(1) 초기 예비종을 포함한 채집 대상종 : 23종(절지동물(곤충) 9종, 연체동물 8종, 양서류 6종)

(2) 채집 완료 종 : 9종(절지동물(곤충) 5종, 연체동물 1종, 양서류 3종)

나) 멸종위기동물의 Genome survey

(1) Library QC data

- DNA Library QC

Delivery name

Tape

Concentration

(ng/ul)

Volume

(ul)

Tape Quantity

(ug)

Main peak Size

(bp)

Result

수염풍뎅이

87.237

6.979

470

pass

그림입니다.
원본 그림의 이름: Pl_DNA_QC.jpg
원본 그림의 크기: 가로 1387pixel, 세로 679pixel
사진 찍은 날짜: 2017년 11월 13일 오후 13:57
프로그램 이름 : Adobe Photoshop CC (Windows)

- RNA Library QC

Delivery name

Tape

Concentration

(ng/ul)

Volume

(ul)

Tape Quantity

(ug)

Main peak Size

(bp)

Result

수염풍뎅이

325.732

9.772

288

pass

그림입니다.
원본 그림의 이름: Pl_RNA_QC.jpg
원본 그림의 크기: 가로 1387pixel, 세로 679pixel
사진 찍은 날짜: 2017년 11월 13일 오후 13:51
프로그램 이름 : Adobe Photoshop CC (Windows)

(2) 고품질 genomic DNA 채취 및 표본확보

- 검수용 DNA는 대부분 만족하였고, 멸종위기종인 대상종들은 채집량의 제한으로 인해 확증표본으로 제출 가능한 표본을 확보하지 못하여 사진으로 대체하고자 함.

검수용 샘플 DNA 농도 및 총 양 현황표
Sample 명	농도(ng/ul)	Volume(ul)	DNA 총량(ug)	O.D A260/280	추출일자	저장장소
수염풍뎅이	589	300	176.7	1.94	170927	1XTE pH8.0

(3) 기타분석

A. Genome Size estimation – Jellyfish 프로그램

각 대상종을 대상으로 Jellyfish 프로그램으로 Genome size를 예측한 결과는 아래와 같다. 각 분석은 k-mer 값 17mer, 19mer, 21mer를 대상으로 하였고 그것을 통해 예측된 genome의 크기는 Estimation genome size 에 표시되었고, 이를 통해 이번 사업에서 분석한 서열의 양의 coverage는 Genome coverage depth(Coverage Depth)에 표기되었다. 그리고 각 종의 표 아래 그래프는 kmer값 별로 나타난 depth의 예측 그래프로 peak값을 확인할 수 있다.

샘플명	K-mer (K-mersize)	Estimateddepth (K-merCoveragedepth)	Genomecoveragedepth (Coveragedepth)	Estimatedgenome size
수염풍뎅이	17	23	25.73	749,546,066.7
	19	22	24.98	772,007,211.5
	21	22	25.36	760,398,080.5

그림입니다.
원본 그림의 이름: CLP000008940004.bmp
원본 그림의 크기: 가로 836pixel, 세로 369pixel

B. 반복서열

- 시퀀싱이 완료된 샘플 DNA 의 contigs 중 1kb 이상의 contigs의 반복서열을 탐색 (Repeat masking results of DNA contigs)

수염풍뎅이는 Reference로 15,289 bp 크기의 Usechus lacerta 미토콘드리아 genome을 이용하여 맵핑하였다. 갭은 2,558 bp 로, Coverage 는 83.27%로 확인되었다.

수염풍뎅이의 KOG 결과, “Infomation Storage and Processing” 부분에서는 replication, recombination and repair 관련이 4.2%로 가장 많이 매칭되고, “Cellular Processes and Signaling” 에서는 signal transduction mechanisms (7.1%), post translational modification (5.4%) 로 많이 매칭된다. “Metabolism” 부분은 평균 1% 대로 낮게 매칭되고, Multiple Function 은 19.4% 이다.

수염풍뎅이의 GO 결과, Biological Process에서 cell (1,480개), cell part (1,450개) 순으로 많이 매칭된다. Molecular Function 에서는 binding (2,481개), catalytic activity (2,240개) 순으로 가장 많이 매칭된다. 또한, Cellular Component 부분에서는 metabolic process (2,180개), cellular process (2,114개), single-organism process (1,223개) 순으로 많이 매칭된다.

수염풍뎅이
Repeats	4	5	6	7	8	9	10	11	12	13	…	Total
Di	0	0	178	75	77	34	31	12	16	4		471
Tri	0	203	69	13	9	5	2	2	0	0		303
Tetra	55	14	4	0	0	1	0	0	0	1		75
Penta	2	1	0	0	0	0	0	0	0	0		3
Hexa	2	0	0	0	0	0	0	0	0	0		2
Total	59	218	251	88	86	40	33	14	16	5		854

→ SSR 검색결과 총 854개의 SSR 서열을 확인할 수 있었으며, Di motif 가 471개로 가장 많이 존재하는 것을 확인 할 수 있었으며, 이를 기반으로 하여 SSR marker 후보군에 대한 primer 를 2,326개를 디자인 하였다.

→ 각 종의 유전자를 분석하여 그 종을 구별할 수 있는 primer를 만든다. primer 의 조건은 Motif 약 4~6개이며, Forward 와 Reverse primer 가 18~22개 정도이고 Tm값이 54.5~55.5 정도가 적당하다.

올해 17년도에 채집한 6종의 유전자를 분석하여 그 종을 구별할 수 있는 Barcode 서열을 만들었고, 그 Barcode 서열을 가지고 NCBI (National Center for Biotechnology Information) 사이트에 있는 BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)을 이용하여 결과를 확인하였다. 각 종의 서열들의 BLAST 결과 마커로서 주로 사용되는 COI 서열과 매치되는 것으로 보아 바코드 서열로 사용가능할 것으로 사료된다.