붉은점모시나비 (Parnassius bremeri)

그림입니다.

▣ 국    명 : 붉은점모시나비

▣ 학    명 : Parnassius bremeri Bremer, 1864

▣ 지정번호 : 멸종위기 야생생물 Ⅱ급

 ▣ 계    통 : 절지동물문 > 곤충강 > 나비목 > 호랑나비과
> 모시나비속

◎ 형 태 : 날개를 편 길이는 65~75 mm 정도이다. 모시나비와는 날개에 붉은 점이 있는 점이 다르다. 붉은 점은 개체에 따라 변이가 심하다. 수컷은 배 전체에 연한 노란빛의 긴 털이 있지만 암컷에는 없다. 교미가 끝난 암컷의 배 끝에는 수태낭이 붙어 있다. 날개의 검정 무늬와 뒷날개의 붉은 무늬는 개체에 따라 변화의 폭이 매우 넓다. 수컷은 배 전체에 긴 털이 나 있다.

◎ 생 태 : 산지나 평지의 나무가 별로 없는 양지 바른 풀밭에 살며, 천천히 날아다니면서 나무딸기, 엉겅퀴, 기린초 등에서 꿀을 빤다. 수컷은 이따금 산정상까지 날아오르지만 특별히 나비길을 만들지는 않는다. 성충은 대체로 철쭉이 활짝 필 때 나오고 교미가 끝난 암컷의 배 끝에는 수태낭이 붙어 있다. 암컷은 식초인 기린초 주변에 있는 지표의 죽은 잔가지나 마른 잎에 한 개씩 산란하며 알 속에서 부화한 1령 유충으로 알껍데기 속에서 여름, 가을, 겨울을 지낸다. 유충은 3월 하순에서 4월 초에 알 껍질을 뚫고 나와 식초를 먹고 성장하며 엉성한 고치를 만들고 용화한다.


◎ 분 포 : 경기도, 강원도, 충청북도, 경상도 등지에서 국지적으로 출현하며, 국외에는 중국, 시베리아 등지에 서식한다.

① 채집 정보

- 채 집 자: 빛고을생태연구소 정헌천

- 채집지역: 경상북도 의성군 안계면 도덕리 산 177


그림입니다. 원본 그림의 이름: DSC_0557.JPG 원본 그림의 크기: 가로 3216pixel, 세로 2136pixel 사진 찍은 날짜: 2016년 05월 19일 오후 6:27 카메라 제조 업체 : NIKON CORPORATION 카메라 모델 : NIKON D2Xs 프로그램 이름 : Ver.1.00 F-스톱 : 7.1 노출 시간 : 10/2000초 IOS 감도 : 100 색 대표 : sRGB 노출 모드 : 자동 화이트 밸런스 : 자동

◆ 붉은점모시나비 성충(♂)

 

  그림입니다. 원본 그림의 이름: 20160520_220705.jpg 원본 그림의 크기: 가로 4128pixel, 세로 3096pixel 사진 찍은 날짜: 2016년 05월 20일 오후 10:07 카메라 제조 업체 : SAMSUNG 카메라 모델 : SHV-E330S 프로그램 이름 : E330SKSUDOL4 F-스톱 : 2.2 노출 시간 : 1/30초 IOS 감도 : 100 색 대표 : sRGB 노출 모드 : 자동 35mm 초점 거리 : 31      

◆포획한 수컷 5개체


② 채집현황 및 샘플처리

붉은점모시나비 채집현황

샘플처리

채집일

개체 수

DNAseq

RNAseq

표본

2016.05.20

5 EA

2 EA

2 EA

1 EA


③ 기존 NCBI Taxonomy 유전정보 현황

유전정보 종류

Parnassius 속 유전자원

Parnassius bremeri 유전자원

Nucleotide

1,743

27

Protein

1,600

60

Genome

6

1

Gene

165

13


④ Sequencing 결과

 

붉은점모시나비

Type

Total Reads

Total Bases

Total Bases (Gb)

GC Rate

비고

DNA seq

343,867,574 

43,327,314,324 

43.3 

30.53%

 

RNA seq

311,144,056 

39,204,151,056 

39.2 

38.25%

 


 - Illumina DNA Sequncing 결과

SOAP de novo

PB-DNA hiseq

Input information

　

　

　

Region1

Region2

Total

raw data

Number Of Reads

 

 

171,933,787

171,933,787

343,867,574

Number Of Bases

 

 

21,663,657,162

21,663,657,162

43,327,314,324

error correction

Number Of Reads

 

 

169,194,253

167,614,972

336,809,225

Number Of Bases

 

 

20,441,355,488

20,174,655,280

40,616,010,768

pair reads

Number Of Reads

 

 

 

331,929,856

331,929,856

Number Of Bases

 

 

 

40,094,465,189

40,094,465,189

single reads

Number Of Reads

 

 

 

4,879,369

4,879,369

Number Of Bases

 

 

 

521,545,579

521,545,579

Assembly Results

Scaffold Metrics

> 1 bp*

> 100 bp

> 500 bp**

> 1000 bp

> 2000 bp

Number Of Scaffolds

 

1,622,814

524,624

248,318

74,093

Number Of Bases

 

883,479,568

658,892,265

463,304,074

222,048,840

Avg. Scaffold Size

 

544

1,255

1,865

2,996

N50 Scaffold Size

 

1,065

1,465

1,941

2,940

N80 Scaffold Size

 

389

820

1,305

2,301

N90 Scaffold Size

 

209

654

1,145

2,142

largest Scaffold Size

 

31,661

31,661

31,661

31,661

Contig Metrics

> 1 bp*

> 100 bp

> 500 bp**

> 1000 bp

> 2000 bp

Number Of Contigs

41,851,762

2,974,884

241,906

42,304

3,791

Number Of Bases

2,417,084,059

689,704,504

192,793,667

59,336,213

10,002,209

Avg. Contig Size

57

231

796

1,402

2,638

N50 Contig Size

57

276

783

1,340

2,505

N80 Contig Size

35

136

588

1,105

2,148

N90 Contig Size

34

114

541

1,049

2,071

Largest Contig Size

17,365

17,365

17,365

17,365

17,365

 

 - Illumina RNA Sequncing 결과

Total number of raw reads

- Number of sequences

311,144,056

- Number of bases

39,204,151,056

Contig information

- Total number of  contig

304,236

- Number of bases

177,709,725

- Mean length of contig (bp)

584.1

- N50 length of contig (bp)

755

- GC % of contig

38.87

- Largest contig (bp)

29,057

- No. of large contigs (≥500bp)

86,349

Unigene information

- Total number of  unigenes

70,558

- Number of bases

67,212,453

- Mean length of unigene (bp)

952.5

- N50 length of unigene (bp)

1,608

- GC % of unigene

38.84

- Length ranges (bp)

207 – 36,832

 

2) 현재 상황에 대한 고찰

(1) 고품질 genomic DNA 채취 및 표본확보

- 검수용 DNA는 대부분 만족하였고 멸종위기종인 대상종들은 채집량의 제한으로 인해 확증표본으로 제출가능한 표본을 확보하지 못하여 사진으로 대처하고자 함.


검수용  샘플 DNA 농도 및 총 양, 확증표본 현황표

Sample 명

농도(ng/ul)

Volume(ul)

DNA 총량(ug)

저장장소

확증표본

붉은점모시나비

169.1

79.83

13.5

1XTE pH8.0

O


(2) 기타분석

A. Genome Size estimation – Jellyfish 프로그램


각 대상종을 대상으로 Jellyfish 프로그램으로 Genome size를 예측한 결과는 아래와 같다. 각 분석은 k-mer 값 17mer, 19mer, 21mer를 대상으로 하였고 그것을 통해 예측된 genome의 크기는 Estimation genome size 에 표시되었고, 이를 통해 이번 사업에서 분석한 서열의 양의 coverage는 Genome coverage depth(Coverage Depth)에 표기되었다. 그리고 각 종의 표 아래 그래프는 kmer값 별로 나타난 depth의 예측 그래프로 peak값을 확인할 수 있다.




그림입니다. 원본 그림의 이름: CLP00001208000e.bmp 원본 그림의 크기: 가로 908pixel, 세로 587pixel


B. 반복서열

-  시퀀싱이 완료된 샘플 DNA 의 contigs 중 1kb 이상의 contigs의 반복서열을 탐색 (Repeat masking results of DNA contigs)


붉은점모시나비 (Parnassius bremeri)

 

붉은점모시나비 (Parnassius bremeri) 는 1kb 이상의 contig 의 반복서열은 37,784개 read (52,940,062 bp) 이고, GC level 은 34.41%이다. Repeat Masking 으로 나온 반복서열은 18,233 bp (전체의 0.03%) 만큼 있다. Small RNA 은 42개 read (3,005 bp) 이 있다.

sequences: 37,784

 

total length : 52,940,062 bp (52,940,062 bp excl N/X-runs)

 

GC level : 34.41%

 

bases masked : 18,233 bp ( 0.03%)

 

　

number of

elements

length

occupied

percentage

of sequence

 

SINEs: 

3

137 bp

0.00%

 

　

ALUs 

0

 0 bp

0.00%

 

　

MIRs 

1

 47 bp

0.00%

 

LINEs: 

45

4,219 bp

0.01%

 

　

LINE1 

6

 388 bp

0.00%

 

　

LINE2 

9

 478 bp

0.00%

 

　

L3/CR1 

16

1,029 bp

0.00%

 

LTRelements: 

8

 750 bp

0.00%

 

　

ERVL 

1

 78 bp

0.00%

 

　

ERVL-MaLRs

1

 50 bp

0.00%

 

　

ERV_classI 

2

 112 bp

0.00%

 

　

ERV_classII

0

 0 bp

0.00%

 

DNAelements: 

74

9,374 bp

0.02%

 

　

hAT-Charlie 

20

 1,917 bp

0.00%

 

　

TcMar-Tigger

5

 545 bp

0.00%

 

Unclassified: 

4

300 bp

0.00%

 

Total interspersed repeats:

　

14,780 bp

0.03%

 

Small RNA:

42

3,005 bp

0.01%

 

Satellites:

7

448 bp

0.00%

 

 




C. Mito-genome Map

그림입니다. 원본 그림의 이름: 2016_Mito_mapping-붉은점모시나비.jpg 원본 그림의 크기: 가로 3764pixel, 세로 1200pixel 사진 찍은 날짜: 2016년 11월 27일 오후 2:12 프로그램 이름 : Adobe Photoshop CC (Windows) 색 대표 : sRGB

붉은점모시나비는 Reference로 15,389 bp 크기의 Parnassius bremeri 미토콘드리아 genome을 이용하여 맵핑하였다. 갭은 42 bp 가 나왔고, Coverage 는 99.7%로 확인되었다.

D. Transcriptome data 분석

-  붉은점모시나비

그림입니다. 원본 그림의 이름: CLP00001208001a.bmp 원본 그림의 크기: 가로 912pixel, 세로 578pixel


붉은점모시나비의 KOG 결과, “Infomation Storage and Processing” 부분에서 RNA processing and modification 이 4% 로 가장 많이 매칭되었고, “Cellular Processes and Signaling” 에서는 signal transduction mechanisms 이 6%, post translational modification 이 5.2% 로 많이 발현된다. 또한 Metabolism 부분에서는 평균 1.5% 대로 낮게 매칭되고, Multiple Function 은 26.8% 이다.

그림입니다. 원본 그림의 이름: GO_정리본-붉은점모시나비.jpg 원본 그림의 크기: 가로 4413pixel, 세로 2931pixel 사진 찍은 날짜: 2016년 11월 27일 오후 10:30 프로그램 이름 : Adobe Photoshop CC (Windows) 색 대표 : sRGB


붉은점모시나비의 GO 결과, Biological Process 에서 metabolic process (3,000개), cellular process (2,902개) 순으로 많이 발현된다. Molecular Function 에서는 catalytic activity (3,002개), binding (2,171개) 순으로 가장 많이 매칭된다. 또한, Cellular Component 부분에서는 membrane (1,808개), membrane part (1,395개), cell (1,126개), cell part (1,102개) 순으로 많이 매칭된다.

(4) Microsatellite 후보군

A. SSR statistics


붉은점모시나비

Repeats

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

Di

0

0

334

118

80

59

39

26

38

29

Tri

0

643

231

66

24

2

0

0

0

0

Tetra

591

77

13

1

0

0

0

0

0

0

Penta

107

5

1

0

0

0

0

0

0

0

Hexa

15

2

0

0

0

0

0

0

0

0

Total

713

727

579

185

104

61

39

26

38

29


→ SSR 검색결과 총 2,501개의 SSR 서열을 확인할 수 있었으며, Tri motif 가 966개로 가장 많이 존재하는 것을 확인 할 수 있었으며, 이를 기반으로 하여 SSR marker 후보군에 대한 primer 를 1,565개 디자인 하였다.



B. Primer sequence

→ 각 종의 유전자를 분석하여 그 종을 구별할 수 있는 primer를 만든다. primer 의 조건은 Motif 약 4~6개이며, Forward 와 Reverse primer 가 18~22개 정도이고 Tm값이 54.5~55.5 정도가 적당하다.


- 붉은점모시나비

Sequence

Motif

Forward Primer

Tm

Reverse Primer

83489630

(TCAAC)4

TAGCATGTTTTGTGTTCACTG

54.88

AATTCAATCAAAAGTCTGAACC

55.06

83489634

(TAGTT)4

CCCATCTCCTGATTTAGTTTT

55.01

TAATAGCACGCTGAGACAGTT

55.41

83489742

(TAAA)4

GGGGTTCTTTGTTTTATGAAT

54.87

TGTCTGTTCAAATACCTTGTTG

55.41

83505841

(CCGC)4

GCTCGACTGAATTGATAAGTG

55.13

CCCATTTAATAACCACTCTTG

54.01

83505895

(TCTT)4

CGAAGAGTGGCTTTGTAAGTA

54.99

GAGTGGTTTACCGATTTTTATC

54.67

83505951

(GGTGCA)4

ACGAGTATTGCATTCTTCTTG

54.74

ACTTCAGATGGGGGTAATAAG

54.89

83523356

(ATGG)4

AGAACCGTAGACCTTTTGACT

54.74

TTGATGGTAATCAAATTCTGC

55.32

83523396

(TTAT)4

CGTGAACATGGTGTTTTACTT

55.26

CATCAAAGTGCTGAATATGGT

55.26

83523632

(ACAT)4

ATCTATCCAGCCGTTTAGTCT

54.79

GGTGCTTTTTGTCACTCTTAC

54.19

83539823

(CAGA)4

CTTCCTTCGTACAAAATTTCA

54.74

CAACAAACAACAACAAACAAC

54.17

83540363

(ATTT)4

GGTTTGGAAAATTATCTTTCTG

54.8

TTTAAGAAACATGGTGGTGAT

54.67

83540479

(TATT)4

ACGATATGTAATTCACGCAAC

55.3

ATCTGGTGGTCTTCAATTTTT

55.31

83554776

(ACGAC)4

TAATAAGCCCAAAATATCACG

54.7

GTCCCCAAGACCACTAGTTTA

55.83

83554798

(AATTT)4

CTTAAGAAAGGTTCTTGAAAGG

54.39

CAAAATATCTCCCCTAAGAGC

54.87

C. 바코드 서열


    요번 16년도에 채집한 11종의 유전자를 분석하여 그 종을 구별할 수 있는 Barcode 서열을 만들었고, 그 Barcode 서열을 가지고 NCBI (National Center for Biotechnology Information) 사이트에 있는 BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)을 이용하여 결과를 확인하였다. 각 종의 서열들의 BLAST 결과 마커로서 주로 사용되는 COI 서열과 매치되는 것으로 보아 바코드 서열로 사용가능할 것으로 사료된다.


   그림입니다. 원본 그림의 이름: CLP00006838001e.bmp 원본 그림의 크기: 가로 802pixel, 세로 564pixel


(5) QC 결과

DNA Library QC

Name

Concentration 

 (ng/ul)

Volume

(ul)

Quantity 

(ug)

Main peak Size (bp)

Result

붉은점모시나비

169.1

79.83

13.5

500

pass


RNA Library QC

Name

Concentration 

 (ng/ul)

Volume

(ul)

Quantity 

(ng)

Main peak Size (bp)

Result

붉은점모시나비

41

2.22

18.5

326

Pass


(6) Gene prediction

샘플종

Number of  Contig (>1kb)

Number of Bases (>1kb)

N50 Contig Size

Number of gene prediction

붉은점모시나비

37,784

52,940,062

1,337

14,742


각종별로 transcriptome 서열을 대상으로 1kb 이상만을 선택하여 Gene predcition 한 결과 위의 매칭된 contig, base 수는 위의 표와 같고 N50되는 Contig의 길이도 보통 1~3kb 정도로 나타났다. 그리고 이들을 통해 예측된 유전자의 수는 2천개에서 10만개 이상으로 다양하게 예측되었다.


※ Long contig의 Gene prediction 결과 그림 예시

그림입니다. 원본 그림의 이름: CLP000068380004.bmp 원본 그림의 크기: 가로 934pixel, 세로 583pixel