꼬마잠자리 (Nannophya pygmaea)
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▣ 국 명 : 꼬마잠자리 ▣ 학 명 : Nannophya pygmaea Rambur, 1842 ▣ 지정번호 : 멸종위기 야생생물 Ⅱ급 ▣ 계 통 : 절지동물문 > 곤충강 > 잠자리목 > 잠자리과 |
◎ 형 태 : 성충은 배길이 11~13 mm, 뒷날개 길이 13~15 mm, 유충은 몸길이 8~9 mm, 성충일 때 수컷의 몸은 등황색으로 배의 각 마디에 미색의 띠무늬가 있고, 성숙하면 몸 전체가 적색이 된다. 암컷은 배 제 2~6마디 사이에 미색 띠무늬와 담갈색과 흑색의 가로줄 무늬가 있어 마치 색동저고리처럼 알록달록하게 보이고, 제 7~10마디에는 가는 미색 띠무늬가 있으며, 그밖에는 거의 흑색이다. 암수 모두 날개는 투명하고, 각 날개 밑 부분의 삼각실 바깥까지는 등적색을 띠고 있다.
◎ 생 태 : 수컷은 1 m 내외의 영역을 확보하여 영역 경계활동을 한다. 서식처는 작은 풀들이 서식하고 있는 얕은 습지이며, 서식지에는 산이나 주변의 연못 등에서 항상 물이 공급되어 마르지 않는 습지를 형성하는 독특한 생태환경을 이루고 있다. 산속의 휴경화된 계단형 습지 논에서 주로 서식한다. 오후 1~3시경 낮 기온이 최고에 이르면 풀줄기 끝에서 물구나무서듯 배를 하늘 높이 쳐들어 체온을 조절하는 행동을 한다. 성숙한 유충은 약 7 mm 정도의 크기로 서식지의 물이 일시적으로 말라 건조해지더라도 이를 견뎌내는 내성이 매우 강하다.
◎ 분 포 : 국내에는 37? 이남 중. 남부지방, 국외에는 일본, 중국(중부·남부), 타이완 등
① 채집 정보
- 채 집 자: 빛고을생태연구소 정헌천
- 채집지역: 전라남도 함평군 해보면 일대
◆ 꼬마잠자리 성충(♂) ◆ 꼬마잠자리 성충(♀)
◆포획한 수컷 5개체
② 채집현황 및 샘플처리
|
꼬마잠자리 채집현황 |
샘플처리 |
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|
채집일 |
개체 수 |
DNAseq |
RNAseq |
표본 |
|
2016.06.20 |
5 EA |
2 EA |
2 EA |
1 EA |
③ 기존 NCBI Taxonomy 유전정보 현황
|
유전정보 종류 |
Nannophya 속 유전자원 |
Nannophya pygmaea 유전자원 |
|
Nucleotide |
224 |
219 |
|
Protein |
204 |
203 |
|
Genome |
1 |
1 |
|
Gene |
37 |
37 |
④ Sequencing 결과
|
꼬마잠자리 |
|||||
|
Type |
Total Reads |
Total Bases |
Total Bases (Gb) |
GC Rate |
비고 |
|
DNA seq |
309,146,652 |
46,681,144,452 |
46.7 |
35.7 |
수컷 |
|
RNA seq |
61,255,526 |
9,249,584,426 |
9.2 |
37.7 |
|
|
69,532,274 |
10,499,373,374 |
10.5 |
38.9 |
암컷 |
|
- Illumina DNA Sequncing 결과
|
SOAP de novo |
|||||
|
NP-DNA hiseq |
|||||
|
Input information |
|||||
|
|
|
|
Region1 |
Region2 |
Total |
|
raw data |
|||||
|
Number Of Reads |
|
|
154,573,326 |
154,573,326 |
309,146,652 |
|
Number Of Bases |
|
|
23,340,572,226 |
23,340,572,226 |
46,681,144,452 |
|
error correction |
|||||
|
Number Of Reads |
|
|
154,225,700 |
150,868,624 |
305,094,324 |
|
Number Of Bases |
|
|
23,035,165,220 |
21,917,171,628 |
44,952,336,848 |
|
pair reads |
|||||
|
Number Of Reads |
|
|
|
301,453,990 |
301,453,990 |
|
Number Of Bases |
|
|
|
44,438,224,942 |
44,438,224,942 |
|
single reads |
|||||
|
Number Of Reads |
|
|
|
3,640,334 |
3,640,334 |
|
Number Of Bases |
|
|
|
514,111,906 |
514,111,906 |
|
Assembly Results |
|||||
|
Scaffold Metrics |
> 1 bp* |
> 100 bp |
> 500 bp** |
> 1000 bp |
> 2000 bp |
|
Number Of Scaffolds |
|
959,656 |
221,494 |
149,029 |
102,539 |
|
Number Of Bases |
|
995,704,711 |
861,034,611 |
810,678,931 |
744,481,474 |
|
Avg. Scaffold Size |
|
1,037 |
3,887 |
5,439 |
7,260 |
|
N50 Scaffold Size |
|
6,720 |
8,310 |
8,956 |
9,857 |
|
N80 Scaffold Size |
|
1,193 |
2,969 |
3,699 |
4,713 |
|
N90 Scaffold Size |
|
312 |
1,512 |
2,254 |
3,306 |
|
largest Scaffold Size |
|
155,714 |
155,714 |
155,714 |
155,714 |
|
Contig Metrics |
> 1 bp* |
> 100 bp |
> 500 bp** |
> 1000 bp |
> 2000 bp |
|
Number Of Contigs |
15,741,303 |
1,800,896 |
375,012 |
224,945 |
109,660 |
|
Number Of Bases |
1,602,133,161 |
969,456,798 |
714,214,378 |
607,730,233 |
444,808,970 |
|
Avg. Contig Size |
101 |
538 |
1,904 |
2,701 |
4,056 |
|
N50 Contig Size |
248 |
1,720 |
2,730 |
3,267 |
4,332 |
|
N80 Contig Size |
43 |
303 |
1,194 |
1,710 |
2,743 |
|
N90 Contig Size |
35 |
154 |
821 |
1,331 |
2,350 |
|
Largest Contig Size |
47,762 |
47,762 |
47,762 |
47,762 |
47,762 |
- Illumina RNA Sequncing 결과 (수컷)
|
Total number of raw reads |
|
|
- Number of sequences |
61,255,526 |
|
- Number of bases |
9,249,584,426 |
|
Contig information |
|
|
- Total number of contig |
77,254 |
|
- Number of bases |
45,273,615 |
|
- Mean length of contig (bp) |
586.03 |
|
- N50 length of contig (bp) |
742 |
|
- GC % of contig |
35.44 |
|
- Largest contig (bp) |
6,951 |
|
- No. of large contigs (≥500bp) |
34,986 |
|
Unigene information |
|
|
- Total number of unigenes |
22,194 |
|
- Number of bases |
18,112,143 |
|
- Mean length of unigene (bp) |
816.08 |
|
- N50 length of unigene (bp) |
966 |
|
- GC % of unigene |
35.31 |
|
- Length ranges (bp) |
224 – 6,951 |
2) 현재 상황에 대한 고찰
(1) 고품질 genomic DNA 채취 및 표본확보
- 검수용 DNA는 대부분 만족하였고 멸종위기종인 대상종들은 채집량의 제한으로 인해 확증표본으로 제출가능한 표본을 확보하지 못하여 사진으로 대처하고자 함.
|
검수용 샘플 DNA 농도 및 총 양, 확증표본 현황표 |
|||||
|
Sample 명 |
농도(ng/ul) |
Volume(ul) |
DNA 총량(ug) |
저장장소 |
확증표본 |
|
꼬마잠자리 |
128.698 |
82 |
10.553 |
1XTE pH8.0 |
O |
(2) 기타분석
A. Genome Size estimation – Jellyfish 프로그램
각 대상종을 대상으로 Jellyfish 프로그램으로 Genome size를 예측한 결과는 아래와 같다. 각 분석은 k-mer 값 17mer, 19mer, 21mer를 대상으로 하였고 그것을 통해 예측된 genome의 크기는 Estimation genome size 에 표시되었고, 이를 통해 이번 사업에서 분석한 서열의 양의 coverage는 Genome coverage depth(Coverage Depth)에 표기되었다. 그리고 각 종의 표 아래 그래프는 kmer값 별로 나타난 depth의 예측 그래프로 peak값을 확인할 수 있다.
B. 반복서열
- 시퀀싱이 완료된 샘플 DNA 의 contigs 중 1kb 이상의 contigs의 반복서열을 탐색 (Repeat masking results of DNA contigs)
|
꼬마잠자리 (Nannophya pygmaea) |
|
꼬마잠자리 (Nannophya pygmaea) 는 1kb 이상의 contig 의 반복서열은 224,945개 read (607,730,233 bp) 이고, GC level 은 31.41%이다. Repeat Masking 으로 나온 반복서열은 204,831 bp (전체의 0.05%) 만큼 있다. Small RNA 은 1,115개 read (62,322 bp) 이 있다. |
||||
|
sequences: 224,945 |
|
|||||
|
total length: 607,730,233 bp (607,730,233 bp excl N/X-runs) |
|
|||||
|
GC level : 31.41% |
|
|||||
|
bases masked : 204,831 bp ( 0.05%) |
|
|||||
|
|
number of elements |
length occupied |
percentage of sequence |
|
||
|
|
||||||
|
SINEs: |
1,002 |
56,498 bp |
0.01% |
|
||
|
|
ALUs |
0 |
0 bp |
0.00% |
|
|
|
|
MIRs |
978 |
55,235 bp |
0.01% |
|
|
|
LINEs: |
458 |
28,167 bp |
0.00% |
|
||
|
|
LINE1 |
81 |
4,606 bp |
0.00% |
|
|
|
|
LINE2 |
81 |
4,243 bp |
0.00% |
|
|
|
|
L3/CR1 |
227 |
14,882 bp |
0.00% |
|
|
|
LTRelements: |
81 |
5,149 bp |
0.00% |
|
||
|
|
ERVL |
16 |
947 bp |
0.00% |
|
|
|
|
ERVL-MaLRs |
7 |
349 bp |
0.00% |
|
|
|
|
ERV_classI |
43 |
12,533 bp |
0.00% |
|
|
|
|
ERV_classII |
2 |
118 bp |
0.00% |
|
|
|
DNAelements: |
1,894 |
175,549 bp |
0.03% |
|
||
|
|
hAT-Charlie |
530 |
48,521 bp |
0.01% |
|
|
|
|
TcMar-Tigger |
302 |
28,896 bp |
0.00% |
|
|
|
Unclassified: |
60 |
3,742 bp |
0.00% |
|
||
|
Total interspersed repeats: |
|
269,105 bp |
0.04% |
|
||
|
Small RNA: |
1,115 |
62,322 bp |
0.01% |
|
||
|
Satellites: |
4 |
280 bp |
0.00% |
|
||
C. Mito-genome Map
꼬마잠자리는 Reference로 15,056 bp 크기의 Brachythemis contaminata 미토콘드리아 genome을 이용하여 맵핑하였다. 갭은 219 bp 가 나왔고, Coverage 는 98.5%로 확인되었다.
D. Transcriptome data 분석
- 꼬마잠자리
꼬마잠자리의 KOG 결과, “Infomation Storage and Processing” 에서 replication/recombination/repair 가 5.1% 로 가장 많이 매칭되며, “Cellular Processes and Signaling”에서는 signal transduction mechanisms (7.1%), post translational modification (3.1%) 등이 많이 매칭된다. 또한 Metabolism 에서는 1% 대로 낮게 매칭되고, Multiple Function 은 25.9% 이다.
꼬마잠자리의 GO 결과, Biological Process에서 metabolic process (1,970개), cellular process (1,647개) 순으로 많이 매칭된다. Molecular Function 에서는 binding (2,145개), catalytic activity (1,876개) 순으로 가장 많이 매칭된다. 또한, Cellular Component 부분에서는 cell (1,011개), cell part (1,004개), membrane (770개) 순으로 많이 매칭된다.
(4) Microsatellite 후보군
A. SSR statistics
|
꼬마잠자리 |
|||||||||||
|
Repeats |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
9 |
10 |
11 |
12 |
13 |
14 |
|
Di |
0 |
0 |
334 |
118 |
80 |
59 |
39 |
26 |
38 |
29 |
166 |
|
Tri |
0 |
643 |
231 |
66 |
24 |
2 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
|
Tetra |
591 |
77 |
13 |
1 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
|
Penta |
107 |
5 |
1 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
|
Hexa |
15 |
2 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
|
Total |
713 |
727 |
579 |
185 |
104 |
61 |
39 |
26 |
38 |
29 |
166 |
→ SSR 검색결과 총 2,667개의 SSR 서열을 확인할 수 있었으며, Tri motif 가 966 개로 가장 많이 존재하는 것을 확인 할 수 있었으며, 이를 기반으로 하여 SSR marker 후보군에 대한 primer 를 389개 디자인 하였다.
B. Primer sequence
→ 각 종의 유전자를 분석하여 그 종을 구별할 수 있는 primer를 만든다. primer 의 조건은 Motif 약 4~6개이며, Forward 와 Reverse primer 가 18~22개 정도이고 Tm값이 54.5~55.5 정도가 적당하다.
- 꼬마잠자리
|
Sequence |
Motif |
Forward Primer |
Tm |
|
Reverse Primer |
|||
|
31081440 |
(TTAT)5 |
TTTTCTTCCCCTCTATTGATT |
54.68 |
|
CTACCTGCGGCATAATGTA |
54.86 |
||
|
31086166 |
(TCAA)4 |
TCAATTGGAATACTGAATAACG |
54.58 |
|
TATATACGGGAAGAGGAAAGG |
55.15 |
||
|
31120977 |
(GAAA)4 |
GAGGAGTTCATCCTTAATCTCA |
55.13 |
|
AATGGTATACCTGACATGCAC |
54.96 |
||
|
31122539 |
(TATG)4 |
GAAGCAATACAGAAGAAAGCA |
55.02 |
|
TAGGGCTAAATACACATGGAA |
54.98 |
||
|
31180490 |
(AAAT)4 |
CATGCACAAGCACTACATAAA |
55.02 |
|
GATGAACTTGTCAGCACATTT |
55.29 |
||
|
31190686 |
(CGGA)6 |
TGTGGCATTTAATAAACGAAG |
55.6 |
|
GCACAAGTAAAATGGATACGA |
55.43 |
||
|
31212776 |
(ATTT)4 |
TGCTGTTACATTTGCCTTTAT |
55.2 |
|
AGTAGCTGTATGCGAAAATTG |
54.96 |
||
|
31233134 |
(TTTCA)4 |
ACGTAATCATCCATCTCAATG |
55.02 |
|
CGTAAGAAATGCAGAATCAGT |
54.74 |
||
|
31312293 |
(AGAA)4 |
GGAGATGATTTCACAATTGAC |
54.49 |
|
CTTTCACCTCGTCAAGATTTA |
54.72 |
||
|
31316149 |
(AAGG)4 |
TACCATGGATCTTTGAATCAT |
54.49 |
|
TCCAGTTTAAGGCTTGACATA |
55.16 |
||
|
31325013 |
(TGTA)4 |
CCTATGCATGTGTATTGTTTG |
54.2 |
|
AAGAAAGTTAATCTGGGTTCG |
55.24 |
||
|
31415952 |
(GGTTG)5 |
TCGGCTAAAAACGAAATAAC |
54.85 |
|
ATAGACATGGACGTCAACCTA |
54.67 |
||
|
31418226 |
(ATAA)5 |
TATTCGCGTTAGAAATGAATC |
54.78 |
|
ATGAGAAATTTATTGGCAAGG |
55.97 |
||
|
31419622 |
(TATTG)4 |
TGACTTATGAAAACCTCAAGC |
54.7 |
|
AAATTTTTGGAGCCCTAGTC |
55.14 |
C. 바코드 서열
요번 16년도에 채집한 11종의 유전자를 분석하여 그 종을 구별할 수 있는 Barcode 서열을 만들었고, 그 Barcode 서열을 가지고 NCBI (National Center for Biotechnology Information) 사이트에 있는 BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)을 이용하여 결과를 확인하였다. 각 종의 서열들의 BLAST 결과 마커로서 주로 사용되는 COI 서열과 매치되는 것으로 보아 바코드 서열로 사용가능할 것으로 사료된다.
(5) QC 결과
|
DNA Library QC |
|||||
|
Name |
Concentration (ng/ul) |
Volume (ul) |
Quantity (ug) |
Main peak Size (bp) |
Result |
|
꼬마잠자리 |
87.99 |
3.27 |
288.03 |
470 |
pass |
|
RNA Library QC |
|||||
|
Name |
Concentration (ng/ul) |
Volume (ul) |
Quantity (ng) |
Main peak Size (bp) |
Result |
|
꼬마잠자리 |
51.9 |
5.59 |
290.35 |
275 |
Pass |
(6) Gene prediction
|
샘플종 |
Number of Contig (>1kb) |
Number of Bases (>1kb) |
N50 Contig Size |
Number of gene prediction |
|
꼬마잠자리 |
224,945 |
607,730,233 |
3,267 |
143,206 |
각종별로 transcriptome 서열을 대상으로 1kb 이상만을 선택하여 Gene predcition 한 결과 위의 매칭된 contig, base 수는 위의 표와 같고 N50되는 Contig의 길이도 보통 1~3kb 정도로 나타났다. 그리고 이들을 통해 예측된 유전자의 수는 2천개에서 10만개 이상으로 다양하게 예측되었다.
※ Long contig의 Gene prediction 결과 그림 예시
