두타산입술대고둥아재비 Mirus junensis (Kwon & Lee, 1991)
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▣ 국 명 : 두타산입술대고둥아재비 ▣ 학 명 : Mirus junensis Kwon & Lee, 1991 ▣ 지정번호 : 관찰종 ▣ 계 통 : 연체동물문 > 복족강 > 병안목 > 입술대고둥아재비과 > 입술대고둥아재비속 |
◎ 형 태 : 각고 26mm , 각경 8.5mm. 나층은 8-9층이며 나탑이 높다. 패각은 연한 황갈색이며 전면에 옅은 광택이 있다. 각구는 긴 난형이고 두꺼워 지지 않고 넓게 퍼지나 뒤로 젖혀지지 않고 백색을 띤다. 제공은 좁고 얕으며 축순은 각축과 비껴져서 제공을 덮는다. 활층은 형성되어 있으나 발달되어 있지는 않다.
◎ 생 태 : 자웅이체이며 수정된 난은 한 번에 산란하고 발생은 직접 이루어진다. 숲 속의 습기 높은 관목림 밑이나 잔 돌 바닥에 서식한다.
◎ 분 포 : 강원도 동해시 두타산.
① 채집정보
- 채 집 자 : 강원대학교 이준상 교수님
- 채집지역 : 강원도
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두타산입술대고둥아재비 서식지 및 포획장소 환경 |
채집한 두타산입술대고둥아재비 2개체 |
② 채집현황 및 샘플처리
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두타산입술대고둥아재비 채집현황 |
샘플처리 |
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채집일 |
개체 수 |
DNAseq |
RNAseq |
표본 |
|
2017.09.16 |
2 EA |
1 EA |
1 EA |
ㅡ |
③ NCBI Taxonomy 유전정보 현황
|
유전정보 종류 |
Family Enidae 유전자원 |
Mirus junensis 유전자원 |
|
Nucleotide |
364 |
- |
|
Protein |
145 |
- |
④ Sequencing 결과
|
Type |
Total Reads |
Total Bases |
Total Bases (Gb) |
GC Rate |
비고 |
|
DNA |
232,819,692 |
35,155,773,492 |
35.1 |
38.8 |
|
|
RNA |
103,081,572 |
15,565,317,372 |
15.5 |
42.2 |
|
- Illumina DNA Sequencing 결과
|
SOAP de novo |
|||||
|
Mj_DNA hiseq |
|||||
|
Input information |
|||||
|
|
|
|
Region1 |
Region2 |
Total |
|
raw data |
|||||
|
Number Of Reads |
|
|
116,409,846 |
116,409,846 |
232,819,692 |
|
Number Of Bases |
|
|
17,577,886,746 |
17,577,886,746 |
35,155,773,492 |
|
error correction |
|||||
|
Number Of Reads |
|
|
115,077,187 |
111,683,234 |
226,760,421 |
|
Number Of Bases |
|
|
16,073,390,867 |
14,881,161,899 |
30,954,552,766 |
|
pair reads |
|||||
|
Number Of Reads |
|
|
|
221,283,750 |
221,283,750 |
|
Number Of Bases |
|
|
|
30,257,561,608 |
30,257,561,608 |
|
single reads |
|||||
|
Number Of Reads |
|
|
|
5,476,671 |
5,476,671 |
|
Number Of Bases |
|
|
|
696,991,158 |
696,991,158 |
|
Assembly Results |
|||||
|
Scaffold Metrics |
> 100 bp |
> 500 bp |
> 1000 bp |
> 2000 bp |
|
|
Number Of Scaffold |
|
2,473,296 |
669,513 |
253,242 |
43,891 |
|
Number Of Bases |
|
1,075,401,090 |
690,853,630 |
398,526,544 |
114,900,338 |
|
Avg. Scaffold Size |
|
434 |
1,031 |
1,573 |
2,617 |
|
N50 Scaffold Size |
|
733 |
1,122 |
1,569 |
2,526 |
|
N80 Scaffold Size |
|
296 |
708 |
1,189 |
2,172 |
|
N90 Scaffold Size |
|
162 |
599 |
1,090 |
2,081 |
|
Largest Scaffold Size |
|
49,199 |
49,199 |
49,199 |
49,199 |
|
Contigs |
> 0 bp |
> 100 bp |
> 500 bp |
> 1000 bp |
> 2000 bp |
|
Number Of Contigs |
41,102,438 |
4,409,423 |
229,710 |
17,070 |
209 |
|
Number Of Bases |
2,547,667,538 |
964,552,050 |
159,375,819 |
21,509,938 |
1,429,366 |
|
Avg. Contig Size |
61 |
218 |
693 |
1,260 |
6,839 |
|
N50 Contig Size |
65 |
247 |
674 |
1,174 |
20,057 |
|
N80 Contig Size |
36 |
141 |
555 |
1,055 |
2,587 |
|
N90 Contig Size |
34 |
117 |
526 |
1,025 |
2,181 |
|
largest Contig Size |
49,199 |
49,199 |
49,199 |
49,199 |
49,199 |
- Illumina RNA Sequencing 결과
|
Total number of raw reads |
|
|
- Number of sequences |
103,081,572 |
|
- Number of bases |
15,565,317,372 |
|
Contig information |
|
|
- Total number of contig |
655,234 |
|
- Number of bases |
384,755,824 |
|
- Mean length of contig (bp) |
587.2 |
|
- N50 length of contig (bp) |
728 |
|
- GC % of contig |
38.76 |
|
- Largest contig (bp) |
4,999 |
|
- No. of large contigs (≥500bp) |
10,713 |
|
Transdecoder information |
|
|
- Total number of contig |
224,172 |
|
- Number of bases |
231,894,458 |
|
- Mean length of contig (bp) |
1034.4 |
|
- N50 length of contig (bp) |
1,788 |
|
- GC % of contig |
41.11 |
|
- Largest contig (bp) |
11,602 |
|
- No. of large contigs (≥500bp) |
19,734 |
|
Unigene information |
|
|
- Total number of unigenes |
53,775 |
|
- Number of bases |
78,357,912 |
|
- Mean length of unigene (bp) |
1,457 |
|
- N50 length of unigene (bp) |
2,251 |
|
- GC % of unigene |
40.89 |
|
- Length ranges (bp) |
131 - 31,559 |
2) 현재 상황에 대한 고찰
가) 대상종 및 시료확보 상황
(1) 초기 예비종을 포함한 채집 대상종 : 23종(절지동물(곤충) 9종, 연체동물 8종, 양서류 6종)
(2) 채집 완료 종 : 9종(절지동물(곤충) 5종, 연체동물 1종, 양서류 3종)
나) 멸종위기동물의 Genome survey
(1) Library QC data
- DNA Library QC
|
Delivery name |
Tape Concentration (ng/ul) |
Volume (ul) |
Tape Quantity (ug) |
Main peak Size (bp) |
Result |
|
두타산 입술대고둥아재비 |
69.845 |
74 |
5.169 |
470 |
pass |
|
|
- RNA Library QC
|
Delivery name |
Tape Concentration (ng/ul) |
Volume (ul) |
Tape Quantity (ug) |
Main peak Size (bp) |
Result |
|
두타산 입술대고둥아재비 |
303.763 |
96 |
29.161 |
273 |
pass |
|
|
(2) 고품질 genomic DNA 채취 및 표본확보
- 검수용 DNA는 대부분 만족하였고, 멸종위기종인 대상종들은 채집량의 제한으로 인해 확증표본으로 제출 가능한 표본을 확보하지 못하여 사진으로 대체하고자 함.
|
검수용 샘플 DNA 농도 및 총 양 현황표 |
||||||
|
Sample 명 |
농도(ng/ul) |
Volume(ul) |
DNA 총량(ug) |
O.D A260/280 |
추출일자 |
저장장소 |
|
두타산대입술고둥아재비 |
554 |
800 |
443.2 |
1.76 |
171108 |
1XTE pH8.0 |
(3) 기타분석
A. Genome Size estimation – Jellyfish 프로그램
각 대상종을 대상으로 Jellyfish 프로그램으로 Genome size를 예측한 결과는 아래와 같다. 각 분석은 k-mer 값 17mer, 19mer, 21mer를 대상으로 하였고 그것을 통해 예측된 genome의 크기는 Estimation genome size 에 표시되었고, 이를 통해 이번 사업에서 분석한 서열의 양의 coverage는 Genome coverage depth(Coverage Depth)에 표기되었다. 그리고 각 종의 표 아래 그래프는 kmer값 별로 나타난 depth의 예측 그래프로 peak값을 확인할 수 있다.
|
샘플명 |
K-mer (K-mersize) |
Estimateddepth (K-merCoveragedepth) |
Genomecoveragedepth (Coveragedepth) |
Estimatedgenome size |
|
두타산입술대 고둥아재비 |
17 |
12 |
13.42 |
1,309,610,767.5 |
|
19 |
12 |
13.62 |
1,290,209,126.5 |
|
|
21 |
12 |
13.83 |
1,270,807,485.5 |
B. 반복서열
- 시퀀싱이 완료된 샘플 DNA 의 contigs 중 1kb 이상의 contigs의 반복서열을 탐색 (Repeat masking results of DNA contigs)
|
두타산입술대고둥아재비 (Mirus junensis) |
|
두타산입술대고둥아재비 (Mirus junensis) 는 1kb 이상의 contig 의 반복서열은 15,462개 read (33,115,926 bp) 이고, GC level 은 40.77%이다. Repeat Masking 으로 나온 반복서열은 328,814 bp (전체의 0.99%) 만큼 있다. Small RNA 은 10개 read (1,959 bp) 가 있고, Simple repeat 는 5,004개 read (221,407 bp) 가 있다. |
||||
|
sequences: 15,462 |
|
|||||
|
total length: 33,115,926 bp (33,115,926 bp excl N/X-runs) |
|
|||||
|
GC level: 40.77 % |
|
|||||
|
bases masked: 328,814 bp ( 0.99%) |
|
|||||
|
|
number of elements |
length occupied |
percentage of sequence |
|
||
|
|
||||||
|
SINEs: |
4 |
312 bp |
0.00% |
|
||
|
|
ALUs |
0 |
0 bp |
0.00% |
|
|
|
|
MIRs |
1 |
46 bp |
0.00% |
|
|
|
LINEs: |
44 |
5,207 bp |
0.02% |
|
||
|
|
LINE1 |
5 |
217 bp |
0.00% |
|
|
|
|
LINE2 |
9 |
466 bp |
0.00% |
|
|
|
|
L3/CR1 |
16 |
850 bp |
0.00% |
|
|
|
LTRelements: |
4 |
549 bp |
0.00% |
|
||
|
|
ERVL |
0 |
0 bp |
0.00% |
|
|
|
|
ERVL-MaLRs |
1 |
75 bp |
0.00% |
|
|
|
|
ERV_classI |
2 |
107 bp |
0.00% |
|
|
|
|
ERV_classII |
0 |
0 bp |
0.00% |
|
|
|
DNAelements: |
342 |
46,076 bp |
0.14% |
|
||
|
|
hAT-Charlie |
161 |
15,340 bp |
0.05% |
|
|
|
|
TcMar-Tigger |
131 |
24,372 bp |
0.07% |
|
|
|
Unclassified: |
4 |
464 bp |
0.00% |
|
||
|
Total interspersed repeats: |
|
52,608 bp |
0.16% |
|
||
|
Small RNA: |
10 |
1,959 bp |
0.01% |
|
||
|
Satellites: |
1 |
131 bp |
0.00% |
|
||
|
Simple repeats: |
5,004 |
221,407 bp |
0.67% |
|
||
C. Mito-genome Map
두타산입술대고둥아재비는 Reference로 14,100 bp 크기의 Cepaea nemoralis 미토콘드리아 genome을 이용하여 맵핑하였다. 갭은 10,975 bp 로, Coverage 는 21.71%로 확인되었다.
D. Transcriptome data 분석
- 두타산입술대고둥아재비
두타산입술대고둥아재비의 KOG 결과, “Infomation Storage and Processing” 부분에서는 replication, recombination and repair 관련이 3.6%로 가장 많이 매칭되고, “Cellular Processes and Signaling” 에서는 signal transduction mechanisms (12.2%), post translational modification (4.1%) 로 많이 매칭된다. “Metabolism” 부분은 평균 2% 대로 낮게 매칭되고, Multiple Function 은 25.9% 이다.
두타산입술대고둥아재비의 GO 결과, Biological Process에서 membrane (1,150개), cell (1,114개) 순으로 많이 매칭된다. Molecular Function 에서는 binding (1,901개), catalytic activity (1,705개) 순으로 가장 많이 매칭된다. 또한, Cellular Component 부분에서는 cellular process (1,708개), metabolic process (1,610개), single-organism process (940개) 순으로 많이 매칭된다.
(4) Microsatellite 후보군
A. SSR statistics
|
두타산입술대고둥아재비 |
||||||||||||
|
Repeats |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
9 |
10 |
11 |
12 |
13 |
… |
Total |
|
Di |
0 |
0 |
357 |
179 |
115 |
78 |
29 |
43 |
30 |
12 |
|
986 |
|
Tri |
0 |
452 |
142 |
58 |
37 |
3 |
7 |
3 |
0 |
1 |
|
729 |
|
Tetra |
147 |
27 |
23 |
2 |
5 |
3 |
2 |
2 |
2 |
1 |
|
241 |
|
Penta |
24 |
2 |
2 |
0 |
3 |
1 |
0 |
1 |
0 |
0 |
|
35 |
|
Hexa |
3 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
|
3 |
|
Total |
174 |
481 |
524 |
239 |
160 |
85 |
38 |
49 |
32 |
14 |
|
1,994 |
→ SSR 검색결과 총 1,994개의 SSR 서열을 확인할 수 있었으며, Di motif 가 986개로 가장 많이 존재하는 것을 확인 할 수 있었으며, 이를 기반으로 하여 SSR marker 후보군에 대한 primer 를 2,326개를 디자인 하였다.
B. Primer sequence
→ 각 종의 유전자를 분석하여 그 종을 구별할 수 있는 primer를 만든다. primer 의 조건은 Motif 약 4~6개이며, Forward 와 Reverse primer 가 18~22개 정도이고 Tm값이 54.5~55.5 정도가 적당하다.
- 두타산입술대고둥아재비
|
Sequence |
Motif |
Forward Primer |
Tm |
|
Reverse Primer |
|||
|
Mj_Uni_00110 |
(AC)18 |
TGAGGGAAAAATGACCTCTAT |
55.4 |
|
CTCGTGCCTGATTTATTTATT |
53.88 |
||
|
Mj_Uni_00254 |
(ATG)8 |
AACCACAGCTGGAATTATTTT |
55.5 |
|
ATCATCTGGTGGGATTGTT |
55.04 |
||
|
Mj_Uni_00321 |
(AT)13 |
TTACTTTGATTTGTCCAGCAT |
54.99 |
|
CATCTGACCACAAGAACATTT |
55.13 |
||
|
Mj_Uni_00345 |
(GT)11 |
ACAAAGAACCTTTTTGCTTTC |
55.42 |
|
CACTCATTCTCTCTCACATGC |
55.91 |
||
|
Mj_Uni_00508 |
(AC)12 |
CCAGAAAAATGTCAGAAACAG |
55.03 |
|
TACACACGGGGATTAGTGATA |
55.56 |
||
|
Mj_Uni_00509 |
(TG)12 |
TACACACGGGGATTAGTGATA |
55.56 |
|
CCAGAAAAATGTCAGAAACAG |
55.03 |
||
|
Mj_Uni_00509 |
(AC)12 |
CCAGAAAAATGTCAGAAACAG |
55.03 |
|
TACACACGGGGATTAGTGATA |
55.56 |
||
|
Mj_Uni_02988 |
(TGGC)6 |
AGCCTCAATAACAAAAGGTCT |
54.84 |
|
CAGCCAGCCAACCAACCA |
64.33 |
||
|
Mj_Uni_05514 |
(GA)31 |
GAGCAAAACTGCAAGAAATTA |
55.04 |
|
CGCTCTCTCTCTCTCTCTCTT |
54.94 |
||
|
Mj_Uni_05803 |
(AG)24 |
GATTGGCTTCTCTTGTTGTTA |
54.7 |
|
CGGTTGATGGTTGATAAAAT |
55.02 |
||
|
Mj_Uni_05868 |
(TC)13 |
TATTAGCTTAGCCATTTGTGG |
54.91 |
|
GAGTGAGTGAGTGAGTGAGTGA |
55.42 |
||
|
Mj_Uni_05957 |
(TTA)8 |
TGGGCTAGAATGCTAAACTAA |
54.64 |
|
ACTTAAAACTTTGTCGCACAT |
54.27 |
||
|
Mj_Uni_15288 |
(TGA)8 |
ACAGGTGCTACATCTGATGAC |
55.14 |
|
ATTCTCAGGACAGATGACAGA |
54.71 |
||
|
Mj_Uni_15507 |
(AAAT)10 |
AACTTTTATGATTGCCATGTG |
55.27 |
|
AAGCAATTCCTGAAAAATCA |
55.02 |
||
|
Mj_Uni_24683 |
(GA)16 |
AGACGAGGTGGAGAAAGG |
55.15 |
|
TCTCTCCGTCTCTCTCTCTTT |
55.04 |
||
|
Mj_Uni_24819 |
(GA)12 |
ATGAGACCAGGAGAGAGAGAG |
55.15 |
|
CTCCCACAGTAACAGTTGAAT |
54.29 |
C. 바코드 서열
올해 17년도에 채집한 6종의 유전자를 분석하여 그 종을 구별할 수 있는 Barcode 서열을 만들었고, 그 Barcode 서열을 가지고 NCBI (National Center for Biotechnology Information) 사이트에 있는 BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)을 이용하여 결과를 확인하였다. 각 종의 서열들의 BLAST 결과 마커로서 주로 사용되는 COI 서열과 매치되는 것으로 보아 바코드 서열로 사용가능할 것으로 사료된다.
(5) Gene prediction
|
샘플종 |
Number of Contig (>1kb) |
Number of Bases (>1kb) |
N50 Contig Size |
Number of gene prediction |
|
두타산입술대고둥아재비 |
15,462 |
33,115,926 |
1,857 |
5,209 |
각종별로 transcriptome 서열을 대상으로 1kb 이상만을 선택하여 Gene predcition 한 결과 위의 매칭된 contig, base 수는 위의 표와 같고 N50되는 Contig의 길이도 보통 1~3kb 정도로 나타났다. 그리고 이들을 통해 예측된 유전자의 수는 8천개에서 4만개 이상으로 다양하게 예측되었다.
※ Long contig의 Gene prediction 결과 그림 예시
