대모잠자리 (Libellula angelina)

▣ 국    명 : 대모잠자리

▣ 학    명 : Libellula angelina Selys, 1883

▣ 지정번호 : 멸종위기 야생생물Ⅱ급

 ▣ 계    통 : 절지동물문 > 곤충강 > 잠자리목 > 잠자리과
> 대모잠자리속

◎ 형 태 : 성충의 머리는 흑색이고 뒷머리, 이마혹, 이마, 이마조각, 윗입술조각, 윗입술, 아랫입술은 황갈색이다. 가슴은 황색을 띈 흑갈색이고 밑의 몇 마디는 등 쪽이 연한 색이다. 미부 상부기는 갈색이고 9 마디와 길이가 같다. 미부 하부기는 황갈색인데 편평하고 윗끝은 예리하고 위로 구부러졌다. 미모는 황갈색이고 짧다. 날개는 투명하고 현저한 흑갈색 무늬가 날개의 밑, 가운데, 날개 끝에 있어서, 대모라고 불리는 바다거북의 등 무늬와 닮아 대모잠자리라고 명명되었다. 날개 맥은 흑갈색이고 가두리무늬는 갈색이다. 배의 길이는 약 27 mm이고, 뒷날개 길이는 약 33 mm이다.


◎ 생 태 : 수컷은 연못 주위에 소규모의 영역을 확보한 후 갈대의 줄기에 앉아 영역 경계활동을 하며, 암컷은 수컷의 경호를 받으며 수생식물 주위를 비행하며 타수산란을 하고, 산란된 알은 약 일주일 후 부화하여 12회 탈피 후 종령 유충으로 월동에 들어간다. 갈대와 같은 수생식물이 우거져 있고, 유기질이 풍부한 지역에서 서식한다.


◎ 분 포 : 한국, 중국, 일본 등에 분포



① 채집 정보

- 채 집 자: 빛고을생태연구소 정헌천

- 채집지역: 충남 태안군 남면 신온리


묶음 개체입니다.

◆ 대모잠자리 성충 사진

 

  그림입니다. 원본 그림의 이름: 대모잠자리.jpg 원본 그림의 크기: 가로 3744pixel, 세로 2576pixel 사진 찍은 날짜: 2016년 05월 12일 오후 2:55 카메라 제조 업체 : samsung 카메라 모델 : SHV-E330S 프로그램 이름 : Adobe Photoshop CS6 (Windows) F-스톱 : 2.2 색 대표 : sRGB 노출 모드 : 자동 35mm 초점 거리 : 31 프로그램 노출 : 자동 제어 모드 측     

◆ 포획한 대모잠자리 성충 4개체

   

② 채집현황 및 샘플처리

대모잠자리 채집현황

샘플처리

채집일

개체 수

DNAseq

RNAseq

표본

2016.05.13

4 EA

2 EA

1 EA

1 EA


③ 기존 NCBI Taxonomy 유전정보 현황

유전정보 종류

Libellula 속 유전자원

Libellula angelina 유전자원

Nucleotide

208

45

Protein

122

15


④ Sequencing 결과

 

대모잠자리

Type

Total Reads

Total Bases

Total Bases (Gb)

GC Rate

비고

DNA seq

300,317,164 

30,332,033,564 

30.3 

35.5 

 

RNA seq

87,122,752 

8,799,397,952 

8.8 

43.3 

 


 - Illumina DNA Sequncing 결과

SOAP de novo

LA-DNA hiseq

Input information

　

　

　

Region1

Region2

Total

raw data

Number Of Reads

 

 

150,158,582

150,158,582

300,317,164

Number Of Bases

 

 

15,166,016,782

15,166,016,782

30,332,033,564

error correction

Number Of Reads

 

 

149,122,788

145,078,351

294,201,139

Number Of Bases

 

 

14,839,752,442

14,305,675,066

29,145,427,508

pair reads

Number Of Reads

 

 

 

288,591,716

288,591,716

Number Of Bases

 

 

 

28,607,058,766

28,607,058,766

single reads

Number Of Reads

 

 

 

5,609,423

5,609,423

Number Of Bases

 

 

 

538,368,742

538,368,742

Assembly Results

Scaffold Metrics

> 1 bp*

> 100 bp

> 500 bp**

> 1000 bp

> 2000 bp

Number Of Scaffolds

 

765,231

188,335

137,577

100,425

Number Of Bases

 

973,257,032

876,280,739

840,682,002

787,533,063

Avg. Scaffold Size

 

1,271

4,652

6,110

7,842

N50 Scaffold Size

 

8,248

9,498

10,032

10,841

N80 Scaffold Size

 

2,176

3,680

4,231

5,064

N90 Scaffold Size

 

503

1,978

2,599

3,529

largest Scaffold Size

 

125,593

125,593

125,593

125,593

Contig Metrics

> 1 bp*

> 100 bp

> 500 bp**

> 1000 bp

> 2000 bp

Number Of Contigs

12,823,218

1,895,651

517,175

251,070

74,160

Number Of Bases

1,471,532,534

936,266,959

670,345,161

480,495,087

236,875,355

Avg. Contig Size

114

493

1,296

1,913

3,194

N50 Contig Size

351

1,036

1,493

1,978

3,148

N80 Contig Size

56

323

843

1,304

2,356

N90 Contig Size

37

162

666

1,145

2,166

Largest Contig Size

24,998

24,998

24,998

24,998

24,998

 - Illumina RNA Sequncing 결과

Total number of raw reads

- Number of sequences

87,122,752

- Number of bases

8,799,397,952

Contig information

- Total number of  contig

180,564

- Number of bases

256,665,512

- Mean length of contig (bp)

1,421.4

- N50 length of contig (bp)

3,510

- GC % of contig

39.16

- Largest contig (bp)

56,569

- No. of large contigs (≥500bp)

92,595

Unigene information

- Total number of  unigenes

45,987

- Number of bases

112,479,948

- Mean length of unigene (bp)

2,445.9

- N50 length of unigene (bp)

4,830

- GC % of unigene

39.17

- Length ranges (bp)

224 – 49,204

 

2) 현재 상황에 대한 고찰


나) 자생 동물자원 Genome Survey

(1) 고품질 genomic DNA 채취 및 표본확보

- 검수용 DNA는 대부분 만족하였고 멸종위기종인 대상종들은 채집량의 제한으로 인해 확증표본으로 제출가능한 표본을 확보하지 못하여 사진으로 대처하고자 함.


검수용  샘플 DNA 농도 및 총 양, 확증표본 현황표

Sample 명

농도(ng/ul)

Volume(ul)

DNA 총량(ug)

저장장소

확증표본

대모잠자리

62

34

2.11

1XTE pH8.0

O


(2) 기타분석

A. Genome Size estimation – Jellyfish 프로그램


각 대상종을 대상으로 Jellyfish 프로그램으로 Genome size를 예측한 결과는 아래와 같다. 각 분석은 k-mer 값 17mer, 19mer, 21mer를 대상으로 하였고 그것을 통해 예측된 genome의 크기는 Estimation genome size 에 표시되었고, 이를 통해 이번 사업에서 분석한 서열의 양의 coverage는 Genome coverage depth(Coverage Depth)에 표기되었다. 그리고 각 종의 표 아래 그래프는 kmer값 별로 나타난 depth의 예측 그래프로 peak값을 확인할 수 있다.



그림입니다. 원본 그림의 이름: CLP000012080010.bmp 원본 그림의 크기: 가로 908pixel, 세로 595pixel

 


B. 반복서열

-  시퀀싱이 완료된 샘플 DNA 의 contigs 중 1kb 이상의 contigs의 반복서열을 탐색 (Repeat masking results of DNA contigs)


대모잠자리(Libellula angelina)

　

대모잠자리 (Libellula angelina) 는 1kb 이상의 contig 의 반복서열은 251,070개 read (480,495,087 bp) 이고, GC level 은 36.24%이다. Repeat Masking 으로 나온 반복서열은 396,574 bp (전체의 0.08%) 만큼 있다. Small RNA 은 692개 read (39,639 bp) 이 있다.

sequences: 251,070

　

total length: 480,495,087 bp (480,495,087 bp excl N/X-runs)

　

GC level : 36.24%

　

bases masked: 396,574 bp ( 0.08%)

　

　

number of

elements

length

occupied

percentage

of sequence

 

SINEs: 

695

37,370 bp

0.01%

 

　

ALUs 

1

 48 bp

0.00%

 

　

MIRs 

660

35,713 bp

0.01%

 

LINEs: 

446

31,625 bp

0.01%

 

　

LINE1 

63

 3,461 bp

0.00%

 

　

LINE2 

78

 4,822 bp

0.00%

 

　

L3/CR1 

233

16,287 bp

0.00%

 

LTRelements: 

68

5,125 bp

0.00%

 

　

ERVL 

16

 835 bp

0.00%

 

　

ERVL-MaLRs

6

 324 bp

0.00%

 

　

ERV_classI 

29

11,563 bp

0.00%

 

　

ERV_classII

3

 130 bp

0.00%

 

DNAelements: 

3,162

281,466 bp

0.06%

 

　

hAT-Charlie 

576

 49,518 bp

0.01%

 

　

TcMar-Tigger

1,060

 106,218 bp

0.02%

 

Unclassified: 

15

1,398 bp

0.00%

 

Total interspersed repeats:

　

356,984 bp

0.07%

 

Small RNA:

692

39,639 bp

0.01%

 

Satellites:

4

214 bp

0.00%

 

 




C. Mito-genome Map


그림입니다. 원본 그림의 이름: 2016_Mito_mapping-대모잠자리.jpg 원본 그림의 크기: 가로 3796pixel, 세로 1172pixel 사진 찍은 날짜: 2016년 11월 27일 오후 2:10 프로그램 이름 : Adobe Photoshop CC (Windows) 색 대표 : sRGB

대모잠자리는 Reference로 16,823 bp 크기의 Damaster mirabilissimus 미토콘드리아 genome을 이용하여 맵핑하였다. 갭은 419 bp 가 나왔고, Coverage 는 97.5%로 확인되었다.

D. Transcriptome data 분석

-  대모잠자리

그림입니다. 원본 그림의 이름: CLP00001208001d.bmp 원본 그림의 크기: 가로 915pixel, 세로 578pixel


대모잠자리의 KOG 결과, “Infomation Storage and Processing” 부분에서 transctiption 이 3.7% 로 가장 많이 매칭되며 “Cellular Processes and Signaling” 에서는 signal transduction mechanisms (10.5%), post translational modification (4.6%) 등이 많이 매칭된다. 또한 Metabolism 은 carbohydrate transport and metabolism (2.8%) 가장 많이 매칭되고, Multiple Function 은 26.7% 이다.

그림입니다. 원본 그림의 이름: GO_정리본-대모잠자리.jpg 원본 그림의 크기: 가로 4413pixel, 세로 2915pixel 사진 찍은 날짜: 2016년 11월 27일 오후 10:28 프로그램 이름 : Adobe Photoshop CC (Windows) 색 대표 : sRGB


대모잠자리의 GO 결과, Biological Process에서 metabolic process (3,622개), cellular process (3,447개) 순으로 많이 매칭된다. Molecular Function 에서는 catalytic activity (3,308개), binding (3,621개) 순으로 가장 많이 매칭된다. 또한, Cellular Component 부분에서는 membrane (2,723개), cell (2,103개), cell part (2,074개) 순으로 많이 매칭된다.

(4) Microsatellite 후보군

A. SSR statistics


대모잠자리

Repeats

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

Di

0

0

5262

2884

1606

805

572

665

1236

1434

268

Tri

0

4734

1499

532

322

268

7

0

0

0

0

Tetra

2636

347

59

25

3

0

0

0

0

0

0

Penta

137

41

29

0

0

0

0

0

0

0

0

Hexa

41

4

0

0

0

0

0

0

0

0

0

Total

2814

5126

6849

3441

1931

1073

579

665

1236

1434

268


→ SSR 검색결과 총 25,416개의 SSR 서열을 확인할 수 있었으며, Di motif 가 14,732개로 가장 많이 존재하는 것을 확인 할 수 있었으며, 이를 기반으로 하여 SSR marker 후보군에 대한 primer 를 463개 디자인 하였다.


B. Primer sequence

→ 각 종의 유전자를 분석하여 그 종을 구별할 수 있는 primer를 만든다. primer 의 조건은 Motif 약 4~6개이며, Forward 와 Reverse primer 가 18~22개 정도이고 Tm값이 54.5~55.5 정도가 적당하다.


- 대모잠자리

Sequence

Motif

Forward Primer

Tm

Reverse Primer

25159475

(TAAA)4

ATTGTTTTTGCACCTCCTC

55.18

AATTAGCTGTGGAAAGCAAG

54.89

25160617

(ATTT)4

GCATCAGAGTGTGTGTGTGTA

55.5

AAGAACATTATGACCGATTCA

54.74

25258332

(TTAAAC)4

GTGATGCATTCTTTGAAATCT

54.44

ATTCCTATCAGCTTGGGTTAG

55.2

25264936

(TTAT)c6

CATGCATATGTGAAAAATCATC

55.61

CGACATTAATCCTTGAATTTG

54.94

25364134

(TAGAA)5

CTGAAGCGATAAGACCTGATA

54.83

ATACCATTTCTGACATTGCTC

54.31

25368844

(TTTA)4

CCACTGAGGTATCTGACCATA

55.1

GAATTCTTGATGTCTTGATGC

54.83

25422915

(AGAT)4

AATGCATCAAGCAAGTAGTGT

55.08

CTGAACTTAGGATCTGGGTGT

55.83

25442769

(TTCTA)4

ATTCACCCTACAAGAAGATGG

55.75

TCCGAGAGAAAAAGATGAAGT

55.75

25514025

(TATG)4

ACATATTTCTCGGGGTGAG

54.97

TGAACATTCTTTTCACAGACA

54.26

25516259

(ATTT)6

AAAATACTCGCAACACAAAAG

54.85

TTGCATGTATTGTGATATTGG

54.54

25590869

(TAAA)4

TATTATCTTTCGCCACTTTTG

54.88

GTCAGAGCTTCCTTCTTTCAT

55.33

25594353

(CTGTTG)4

CTGTTGTAGTTGTTGCTGTTG

54.53

AACGTTCTTAACGAGCAAGT

54.38

25643397

(TATC)4

TGAACACAGCAAACTATCAGA

54.48

AGTGTGCGACAGAGAGATAGA

55.19

25643473

(TTAAT)5

ATTTTTCACTGATGAATGAGC

54.44

GAATTAGTTGAGGCATTTGAA

54.65

 

C. 바코드 서열


    요번 16년도에 채집한 11종의 유전자를 분석하여 그 종을 구별할 수 있는 Barcode 서열을 만들었고, 그 Barcode 서열을 가지고 NCBI (National Center for Biotechnology Information) 사이트에 있는 BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)을 이용하여 결과를 확인하였다. 각 종의 서열들의 BLAST 결과 마커로서 주로 사용되는 COI 서열과 매치되는 것으로 보아 바코드 서열로 사용가능할 것으로 사료된다.


   그림입니다. 원본 그림의 이름: CLP000068380020.bmp 원본 그림의 크기: 가로 802pixel, 세로 575pixel


(5) QC 결과

DNA Library QC

Name

Concentration 

 (ng/ul)

Volume

(ul)

Quantity 

(ug)

Main peak Size (bp)

Result

대모잠자리

41

14

574

594

pass


RNA Library QC

Name

Concentration 

 (ng/ul)

Volume

(ul)

Quantity 

(ng)

Main peak Size (bp)

Result

대모잠자리

1.4

34

47.6

402

Pass



(6) Gene prediction

샘플종

Number of  Contig (>1kb)

Number of Bases (>1kb)

N50 Contig Size

Number of gene prediction

대모잠자리

251,070

480,495,087

1,978

134,811


각종별로 transcriptome 서열을 대상으로 1kb 이상만을 선택하여 Gene predcition 한 결과 위의 매칭된 contig, base 수는 위의 표와 같고 N50되는 Contig의 길이도 보통 1~3kb 정도로 나타났다. 그리고 이들을 통해 예측된 유전자의 수는 2천개에서 10만개 이상으로 다양하게 예측되었다.


※ Long contig의 Gene prediction 결과 그림 예시

그림입니다. 원본 그림의 이름: CLP000068380004.bmp 원본 그림의 크기: 가로 934pixel, 세로 583pixel