물장군 Lethocerus deyrollei (Vuillefroy,1864)
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▣ 국 명 : 물장군 ▣ 학 명 : Lethocerus deyrollei (Vuillefroy,1864) ▣ 지정번호 : 멸종위기 야생생물 Ⅱ급 ▣ 계 통 : 절지동물문 > 곤충강 > 노린재목 > 물장군과 > 메추리노린재속 |
◎ 형 태 : 몸길이가 48~65mm쯤으로, 물 속에 사는 곤충 가운데 가장 크다. 물자라와 비슷하며, 몸 색깔은 갈색이나 회갈색이다. 머리는 몸에 비해서 작고, 더듬이는 네 마디인데, 각 마디 옆으로 여러 모양의 돌기가 있다. 주둥이는 짧고 크며, 배 끝에는 늘이고 줄일 수 있는 짧은 호흡관이 있다. 앞다리에 있는 낫 모양의 큰 발톱은 몹시 억세어 물 속에 사는 동물을 잡아먹기에 알맞다.
◎ 생 태 : 성충은 5~9월에 출현하며, 논이나 연못 등지에 살며, 물풀이나 막대에 알을 무더기로 낳는다. 올챙이나 어린 물고기는 물론이고 개구리처럼 덩치가 크고 힘센 동물 등을 날카로운 발톱으로 붙잡아서 체액을 빨아먹고 산다.
◎ 분 포 : 한국, 일본, 타이완, 중국 등지에 분포한다.
① 채집정보
- 채 집 자 : 빛고을생태연구소 정헌천
- 채집지역 : 제주특별자치도 제주시
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|
물장군 서식지 및 포획장소 환경 |
채집한 물장군 2개체 |
▣ 채집현황 및 샘플처리
|
두점박이사슴벌레 채집현황 |
샘플처리 |
|||
|
채집일 |
개체 수 |
DNAseq |
RNAseq |
표본 |
|
2017.07.20 |
2 EA |
1 EA |
1 EA |
ㅡ |
▣ NCBI Taxonomy 유전정보 현황
|
유전정보 종류 |
Lethocerus 속 유전자원 |
Lethocerus deyrollei 유전자원 |
|
Nucleotide |
208 |
17 |
|
Protein |
256 |
31 |
|
Genome |
1 |
- |
|
Gene |
73 |
36 |
④ Sequencing 결과
|
Type |
Total Reads |
Total Bases |
Total Bases (Gb) |
GC Rate |
비고 |
|
DNA |
239,268,060 |
36,129,477,060 |
36.1 |
39.5 |
|
|
RNA |
51,298,208 |
7,234,675,735 |
7.2 |
45.8 |
|
- Illumina DNA Sequencing 결과
|
SOAP de novo |
|||||
|
Ld_DNA hiseq |
|||||
|
Input information |
|||||
|
|
|
|
Region1 |
Region2 |
Total |
|
raw data |
|||||
|
Number Of Reads |
|
|
119,634,030 |
119,634,030 |
239,268,060 |
|
Number Of Bases |
|
|
18,064,738,530 |
18,064,738,530 |
36,129,477,060 |
|
error correction |
|||||
|
Number Of Reads |
|
|
115,824,905 |
112,974,466 |
228,799,371 |
|
Number Of Bases |
|
|
16,937,834,715 |
15,793,664,393 |
32,731,499,108 |
|
pair reads |
|||||
|
Number Of Reads |
|
|
|
224,347,236 |
224,347,236 |
|
Number Of Bases |
|
|
|
32,192,050,345 |
32,192,050,345 |
|
single reads |
|||||
|
Number Of Reads |
|
|
|
4,452,135 |
4,452,135 |
|
Number Of Bases |
|
|
|
539,448,763 |
539,448,763 |
|
Assembly Results |
|||||
|
Scaffold Metrics |
> 100 bp |
> 500 bp |
> 1000 bp |
> 2000 bp |
|
|
Number Of Scaffold |
|
522,684 |
120,280 |
80,728 |
56,000 |
|
Number Of Bases |
|
574,510,252 |
506,101,089 |
478,594,518 |
443,552,497 |
|
Avg. Scaffold Size |
|
1,099 |
4,207 |
5,928 |
7,920 |
|
N50 Scaffold Size |
|
7,784 |
9,423 |
10,156 |
11,172 |
|
N80 Scaffold Size |
|
1,506 |
3,265 |
4,012 |
5,027 |
|
N90 Scaffold Size |
|
361 |
1,629 |
2,415 |
3,452 |
|
Largest Scaffold Size |
|
145,765 |
145,765 |
145,765 |
145,765 |
|
Contigs |
> 0 bp |
> 100 bp |
> 500 bp |
> 1000 bp |
> 2000 bp |
|
Number Of Contigs |
10,985,925 |
1,174,057 |
273,214 |
128,769 |
46,115 |
|
Number Of Bases |
978,548,652 |
557,671,294 |
391,179,765 |
289,258,113 |
175,268,944 |
|
Avg. Contig Size |
89 |
474 |
1,431 |
2,246 |
3,800 |
|
N50 Contig Size |
167 |
1,063 |
1,756 |
2,458 |
3,920 |
|
N80 Contig Size |
38 |
287 |
864 |
1,412 |
2,536 |
|
N90 Contig Size |
34 |
147 |
670 |
1,187 |
2,245 |
|
largest Contig Size |
43,789 |
43,789 |
43,789 |
43,789 |
43,789 |
- Illumina RNA Sequencing 결과
|
Total number of raw reads |
|
|
- Number of sequences |
51,298,208 |
|
- Number of bases |
7,234,675,735 |
|
Contig information |
|
|
- Total number of contig |
141,476 |
|
- Number of bases |
156,293,610 |
|
- Mean length of contig (bp) |
1,104.7 |
|
- N50 length of contig (bp) |
2,091 |
|
- GC % of contig |
39.26 |
|
- Largest contig (bp) |
25,277 |
|
- No. of large contigs (≥500bp) |
74,128 |
|
Transdecoder information |
|
|
- Total number of contig |
81,629 |
|
- Number of bases |
173,441,512 |
|
- Mean length of contig (bp) |
2,124.8 |
|
- N50 length of contig (bp) |
3,187 |
|
- GC % of contig |
40.85 |
|
- Largest contig (bp) |
25,277 |
|
- No. of large contigs (≥500bp) |
67,358 |
|
Unigene information |
|
|
- Total number of unigenes |
21,318 |
|
- Number of bases |
54,630,716 |
|
- Mean length of unigene (bp) |
2,562.7 |
|
- N50 length of unigene (bp) |
3,398 |
|
- GC % of unigene |
40.62 |
|
- Length ranges (bp) |
160 – 26,154 |
2) 현재 상황에 대한 고찰
가) 대상종 및 시료확보 상황
(1) 초기 예비종을 포함한 채집 대상종 : 23종(절지동물(곤충) 9종, 연체동물 8종, 양서류 6종)
(2) 채집 완료 종 : 9종(절지동물(곤충) 5종, 연체동물 1종, 양서류 3종)
나) 멸종위기동물의 Genome survey
(1) Library QC data
- DNA Library QC
|
Delivery name |
Tape Concentration (ng/ul) |
Volume (ul) |
Tape Quantity (ug) |
Main peak Size (bp) |
Result |
|
물장군 |
78.639 |
21 |
1.651 |
470 |
pass |
|
|
- RNA Library QC
|
Delivery name |
Tape Concentration (ng/ul) |
Volume (ul) |
Tape Quantity (ug) |
Main peak Size (bp) |
Result |
|
물장군 |
370.647 |
30 |
11.119 |
286 |
pass |
|
|
(2) 고품질 genomic DNA 채취 및 표본확보
- 검수용 DNA는 대부분 만족하였고, 멸종위기종인 대상종들은 채집량의 제한으로 인해 확증표본으로 제출 가능한 표본을 확보하지 못하여 사진으로 대체하고자 함.
|
검수용 샘플 DNA 농도 및 총 양 현황표 |
||||||
|
Sample 명 |
농도(ng/ul) |
Volume(ul) |
DNA 총량(ug) |
O.D A260/280 |
추출일자 |
저장장소 |
|
물장군 |
895 |
300 |
268.5 |
1.91 |
170927 |
1XTE pH8.0 |
(3) 기타분석
A. Genome Size estimation – Jellyfish 프로그램
각 대상종을 대상으로 Jellyfish 프로그램으로 Genome size를 예측한 결과는 아래와 같다. 각 분석은 k-mer 값 17mer, 19mer, 21mer를 대상으로 하였고 그것을 통해 예측된 genome의 크기는 Estimation genome size 에 표시되었고, 이를 통해 이번 사업에서 분석한 서열의 양의 coverage는 Genome coverage depth(Coverage Depth)에 표기되었다. 그리고 각 종의 표 아래 그래프는 kmer값 별로 나타난 depth의 예측 그래프로 peak값을 확인할 수 있다.
|
샘플명 |
K-mer (K-mersize) |
Estimateddepth (K-merCoveragedepth) |
Genomecoveragedepth (Coveragedepth) |
Estimatedgenome size |
|
물장군 |
17 |
44 |
25.73 |
702,199,741.3 |
|
19 |
43 |
24.98 |
723,242,090.5 |
|
|
21 |
42 |
25.36 |
712,366,269.5 |
B. 반복서열
- 시퀀싱이 완료된 샘플 DNA 의 contigs 중 1kb 이상의 contigs의 반복서열을 탐색 (Repeat masking results of DNA contigs)
|
물장군 (Lethocerus deyrollei) |
|
물장군 (Lethocerus deyrollei) 는 1kb 이상의 contig 의 반복서열은 21,318개 read (54,630,716 bp) 이고, GC level 은 40.62%이다. Repeat Masking 으로 나온 반복서열은 911,538 bp (전체의 1.67%) 만큼 있다. Small RNA 은 28개 read (12,408 bp) 가 있고, Simple repeat 는 16,220개 read (718,774 bp) 가 있다. |
||||
|
sequences: 21,318 |
|
|||||
|
total length: 54,630,716 bp (54,630,716 bp excl N/X-runs) |
|
|||||
|
GC level: 40.62 % |
|
|||||
|
bases masked: 911,538 bp ( 1.67%) |
|
|||||
|
|
number of elements |
length occupied |
percentage of sequence |
|
||
|
|
||||||
|
SINEs: |
0 |
0 bp |
0.00% |
|
||
|
|
ALUs |
0 |
0 bp |
0.00% |
|
|
|
|
MIRs |
0 |
0 bp |
0.00% |
|
|
|
LINEs: |
22 |
1,781 bp |
0.00% |
|
||
|
|
LINE1 |
4 |
610 bp |
0.00% |
|
|
|
|
LINE2 |
3 |
203 bp |
0.00% |
|
|
|
|
L3/CR1 |
4 |
203 bp |
0.00% |
|
|
|
LTRelements: |
40 |
3,542 bp |
0.01% |
|
||
|
|
ERVL |
4 |
229 bp |
0.00% |
|
|
|
|
ERVL-MaLRs |
1 |
79 bp |
0.00% |
|
|
|
|
ERV_classI |
30 |
2,270 bp |
0.00% |
|
|
|
|
ERV_classII |
0 |
0 bp |
0.00% |
|
|
|
DNAelements: |
99 |
18,450 bp |
0.03% |
|
||
|
|
hAT-Charlie |
28 |
7,468 bp |
0.01% |
|
|
|
|
TcMar-Tigger |
16 |
3,516 bp |
0.01% |
|
|
|
Unclassified: |
2 |
110 bp |
0.00% |
|
||
|
Total interspersed repeats: |
|
23,883 bp |
0.04% |
|
||
|
Small RNA: |
28 |
12,408 bp |
0.02% |
|
||
|
Satellites: |
5 |
284 bp |
0.00% |
|
||
|
Simple repeats: |
16,220 |
718,774 bp |
1.32% |
|
||
C. Mito-genome Map
물장군은 Reference로 15,326 bp 크기의 Lethocerus deyrollei 미토콘드리아 genome을 이용하여 맵핑하였다. 갭은 2,091 bp 로, Coverage 는 86.3%로 확인되었다.
D. Transcriptome data 분석
- 물장군
물장군의 KOG 결과, “Infomation Storage and Processing” 부분에서는 transcription 관련이 4.5%로 가장 많이 매칭되고, “Cellular Processes and Signaling” 에서는 signal transduction mechanisms (9.6%), post translational modification (5.7%) 로 많이 매칭된다. “Metabolism” 부분은 평균 1% 대로 낮게 매칭되고, Multiple Function 은 20.7% 이다.
물장군의 GO 결과, Biological Process에서 cell (165개), cell part (161개) 순으로 많이 매칭된다. Molecular Function 에서는 catalytic activity (253개), binding (198개) 순으로 가장 많이 매칭된다. 또한, Cellular Component 부분에서는 cellular process (214개), metabolic process (205개), single-organism process (131개) 순으로 많이 매칭된다.
(4) Microsatellite 후보군
A. SSR statistics
|
물장군 |
||||||||||||
|
Repeats |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
9 |
10 |
11 |
12 |
13 |
… |
Total |
|
Di |
0 |
0 |
886 |
584 |
345 |
304 |
165 |
203 |
112 |
37 |
|
3,349 |
|
Tri |
0 |
1,169 |
544 |
194 |
87 |
6 |
10 |
11 |
0 |
0 |
|
2,033 |
|
Tetra |
265 |
55 |
21 |
0 |
1 |
0 |
1 |
0 |
0 |
0 |
|
344 |
|
Penta |
8 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
|
8 |
|
Hexa |
48 |
2 |
1 |
2 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
|
53 |
|
Total |
321 |
1,226 |
1,452 |
780 |
433 |
310 |
176 |
214 |
112 |
37 |
|
5,787 |
→ SSR 검색결과 총 5,787개의 SSR 서열을 확인할 수 있었으며, Di motif 가 3,349개로 가장 많이 존재하는 것을 확인 할 수 있었으며, 이를 기반으로 하여 SSR marker 후보군에 대한 primer 를 6,922개를 디자인 하였다.
B. Primer sequence
→ 각 종의 유전자를 분석하여 그 종을 구별할 수 있는 primer를 만든다. primer 의 조건은 Motif 약 4~6개이며, Forward 와 Reverse primer 가 18~22개 정도이고 Tm값이 54.5~55.5 정도가 적당하다.
- 물장군
|
Sequence |
Motif |
Forward Primer |
Tm |
|
Reverse Primer |
|||
|
Ld_Uni_00027 |
(CAC)7 |
TTCTGTAATGCACTACCCAGT |
54.93 |
|
ATATCCAGGATTTCTTTGACC |
54.76 |
||
|
Ld_Uni_00038 |
(AT)16 |
ATGTTCTCCATTCCGATATTT |
55.2 |
|
TATACGGTATGACCCTAATGG |
54.24 |
||
|
Ld_Uni_00044 |
(TA)15 |
GGTGTCTTGAAACTGTTATGC |
54.88 |
|
TGGGAATTTATTTATCAACCTAC |
54.3 |
||
|
Ld_Uni_00232 |
(TA)17 |
ACAAAAAGGCTCTCTCTGTCT |
55 |
|
CACCCACTCACACATTTAGTT |
55.08 |
||
|
Ld_Uni_00257 |
(TAAT)5 |
GATGCCAGATAATTTATGAACC |
55.37 |
|
GCATCTGTGAGACAATGTTTT |
55.29 |
||
|
Ld_Uni_00282 |
(AT)11 |
ATTCATAAGCCCGAAATTAAG |
55.29 |
|
TAAGCAATTACTTCCATTGGT |
54.16 |
||
|
Ld_Uni_00297 |
(AT)24 |
GAATGAAGCTCCTGAGAAATC |
55.67 |
|
ACAATTGTTTAACGTGGGTAG |
54.41 |
||
|
Ld_Uni_00311 |
(TG)19 |
GGCCTTGTAAAGAAAATCTGT |
55.23 |
|
GGATGAATAATTGTCCTTCTTT |
54.17 |
||
|
Ld_Uni_02091 |
(TA)27 |
ACCGCTTATTAGCCAGTTTAT |
55.02 |
|
TGGCAGCTGTTCACTACTAAT |
55.25 |
||
|
Ld_Uni_02176 |
(AGTGCC)4 |
TCATCAGAAACAACAACAACA |
55.09 |
|
CTTCTGTTACAGTTCCGAAAA |
54.8 |
||
|
Ld_Uni_03862 |
(TA)32 |
TTAAGAAGCAAGGATTGTTTG |
54.9 |
|
TTAAGAAGCAAGGATTGTTTG |
54.9 |
||
|
Ld_Uni_03887 |
(TGA)9 |
AGATCCTTCAGAAGTACCATTG |
55.08 |
|
TTCTTGTTATGTCAGCCTCAT |
54.97 |
||
|
Ld_Uni_03961 |
(AT)25 |
CAACATCAGGTCTGTACACAAT |
55.1 |
|
CAACATCAGGTCTGTACACAAT |
55.1 |
||
|
Ld_Uni_04176 |
(TA)13 |
AAAGTAATGGATTGGTTCAGG |
55.75 |
|
TGCTTTTTAACTACAACAATGC |
55.03 |
||
|
Ld_Uni_05915 |
(AT)23 |
GCATGTGTTCATTATTGGAAG |
55.68 |
|
GCATGTGTTCATTATTGGAAG |
55.68 |
||
|
Ld_Uni_08257 |
(TC)18 |
GGGTGTTGTTGTTTTTCTTT |
54.27 |
|
CCCTTCTTCTTCTTCTTTGTC |
54.92 |
C. 바코드 서열
올해 17년도에 채집한 6종의 유전자를 분석하여 그 종을 구별할 수 있는 Barcode 서열을 만들었고, 그 Barcode 서열을 가지고 NCBI (National Center for Biotechnology Information) 사이트에 있는 BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)을 이용하여 결과를 확인하였다. 각 종의 서열들의 BLAST 결과 마커로서 주로 사용되는 COI 서열과 매치되는 것으로 보아 바코드 서열로 사용가능할 것으로 사료된다.
(5) Gene prediction
|
샘플종 |
Number of Contig (>1kb) |
Number of Bases (>1kb) |
N50 Contig Size |
Number of gene prediction |
|
물장군 |
17,167 |
52,041,625 |
3,398 |
43,151 |
각종별로 transcriptome 서열을 대상으로 1kb 이상만을 선택하여 Gene predcition 한 결과 위의 매칭된 contig, base 수는 위의 표와 같고 N50되는 Contig의 길이도 보통 1~3kb 정도로 나타났다. 그리고 이들을 통해 예측된 유전자의 수는 8천개에서 4만개 이상으로 다양하게 예측되었다.
※ Long contig의 Gene prediction 결과 그림 예시
