곳체두드럭조개 (Lamprotula leai)

그림입니다. 원본 그림의 이름: 좌각겉면백색바탕.jpg 원본 그림의 크기: 가로 1522pixel, 세로 1014pixel 사진 찍은 날짜: 2007년 12월 03일, 오후 5:02

▣ 국    명 : 곳체두드럭조개

▣ 학    명 : Lamprotula leai (Griffith & Pidgeon, 1834)

▣ 지정번호 : ㅡ

 ▣ 계    통 : 연체동물문 > 이매패강 > 석패목 > 석패과
> 두드럭조개속

◎ 형 태 : 각장 69 mm, 각고 44 mm. 패각은 둥근 난형이다. 각피 앞쪽은 황갈색이나 뒤쪽은 검은 녹색이다. 두드럭조개와 비교하여 각고는 짧고 각장이 길어 약간 길쭉하며 패각이 얇고 각폭이 짧아 납작하다. 패각 중앙의 과립상 돌기가 길쭉길쭉하고 전방의 성장맥이 가늘다. 후방에 종륵이 12개 정도 있고 종륵 사이의 간격이 넓으며 후방의 끝이 퍼지면서 얇아진다. 교치는 우각에 주치와 후측치가 각각 1개씩이고 좌각은 각각 2개씩이다. 패각의 내면은 옅은 진주광택을 낸다.


◎ 생 태 : 암수딴몸으로, 바깥쪽 아가미를 보육낭으로 이용해, 보통 10월에서 다음해 4월까지 글로키디움을 보육하는 동계 산란형이다. 모패에서 방출된 글로키디움은 어류의 아가미나 지느러미에 부착해 기생생활을 거친 후 이탈해 유패로 변태한다. 두드럭조개와 서식생태가 유사하다. 수심이 깊고 유속이 빠르며 바닥은 잔자갈이나 돌이 깔린 곳에 주로 서식한다. 


◎ 분 포 : 동강, 북한강, 금강.

① 채집정보

- 채 집 자: 강원대학교 이준상

- 채집지역: 충청남도 금산군 제원면 천내리 일대

묶음 개체입니다.

◆ 포획위치 : 금산군 천내리 일대

 

  그림입니다. 원본 그림의 이름: 충남 금산군 제원면 천내리_2.jpg 원본 그림의 크기: 가로 960pixel, 세로 720pixel

◆ 서식지 환경


그림입니다. 원본 그림의 이름: 곳체두드럭조개.JPG 원본 그림의 크기: 가로 4288pixel, 세로 3216pixel 사진 찍은 날짜: 2016년 08월 03일 오후 12:48 카메라 제조 업체 : PENTAX 카메라 모델 : PENTAX Optio WG-1 프로그램 이름 : Optio WG-1 Ver 1.00 F-스톱 : 4.6 노출 시간 : 1/160초 IOS 감도 : 80 색 대표 : sRGB 노출 모드 : 자동 35mm 초점 거

◆ 포획한 곳체두드럭조개 3개체

  


② 채집현황 및 샘플처리

곳체두드럭조개 채집현황

샘플처리

채집일

개체 수

DNAseq

RNAseq

표본

2016.07.27

3 EA

2 EA

1 EA

-


③ 기존 NCBI Taxonomy 유전정보 현황

유전정보 종류

Lamprotula 속 유전자원

Lamprotula leai 유전자원

Nucleotide

210

85

Protein

280

67

Genome

6

1

Gene

127

13


④ Sequencing 결과

곳체두드럭조개

Type

Total Reads

Total Bases

Total Bases (Gb)

GC Rate

비고

DNA seq

284,029,522 

42,888,457,822 

42.9 

36.2 

 

RNA seq

84,640,852 

8,548,726,052 

8.5 

49.4 

 

 

 - Illumina DNA Sequncing 결과

SOAP de novo

LL-DNA hiseq

Input information

　

　

　

Region1

Region2

Total

raw data

Number Of Reads

 

 

142,014,761

142,014,761

284,029,522

Number Of Bases

 

 

21,444,228,911

21,444,228,911

42,888,457,822

error correction

Number Of Reads

 

 

140,781,703

137,941,533

278,723,236

Number Of Bases

 

 

20,841,374,587

19,823,202,845

40,664,577,432

pair reads

Number Of Reads

 

 

 

275,024,418

275,024,418

Number Of Bases

 

 

 

40,177,453,033

40,177,453,033

single reads

Number Of Reads

 

 

 

3,698,818

3,698,818

Number Of Bases

 

 

 

487,124,399

487,124,399

Assembly Results

Scaffold Metrics

> 1 bp*

> 100 bp

> 500 bp**

> 1000 bp

> 2000 bp

Number Of Scaffolds

 

3,362,743

931,858

476,697

191,338

Number Of Bases

 

1,864,582,572

1,377,111,330

1,056,790,604

657,554,691

Avg. Scaffold Size

 

554

1,477

2,216

3,436

N50 Scaffold Size

 

1,257

1,902

2,469

3,484

N80 Scaffold Size

 

367

916

1,463

2,478

N90 Scaffold Size

 

187

689

1,216

2,224

largest Scaffold Size

 

31,011

31,011

31,011

31,011

Contig Metrics

> 1 bp*

> 100 bp

> 500 bp**

> 1000 bp

> 2000 bp

Number Of Contigs

41,975,416

5,017,378

838,494

364,771

103,781

Number Of Bases

3,450,448,934

1,772,620,549

1,004,538,421

672,090,971

312,457,741

Avg. Contig Size

82

353

1,198

1,842

3,010

N50 Contig Size

106

651

1,375

1,903

2,949

N80 Contig Size

39

183

774

1,286

2,300

N90 Contig Size

35

130

627

1,134

2,141

Largest Contig Size

22,948

22,948

22,948

22,948

22,948

 

 - Illumina RNA Sequncing 결과

Total number of raw reads

- Number of sequences

84,640,852

- Number of bases

8,548,726,052

Contig information

- Total number of  contig

214,929

- Number of bases

125,863,638

- Mean length of contig (bp)

585.6

- N50 length of contig (bp)

721

- GC % of contig

37.47

- Largest contig (bp)

24,610

- No. of large contigs (≥500bp)

68,522

Unigene information

- Total number of  unigenes

50,607

- Number of bases

52,650,133

- Mean length of unigene (bp)

1,040.3

- N50 length of unigene (bp)

1,477

- GC % of unigene

37.34

- Length ranges (bp)

224 – 37,435

 

2) 현재 상황에 대한 고찰

나) 자생 동물자원 Genome Survey

(1) 고품질 genomic DNA 채취 및 표본확보

- 검수용 DNA는 대부분 만족하였고 멸종위기종인 대상종들은 채집량의 제한으로 인해 확증표본으로 제출가능한 표본을 확보하지 못하여 사진으로 대처하고자 함.


검수용  샘플 DNA 농도 및 총 양, 확증표본 현황표

Sample 명

농도(ng/ul)

Volume(ul)

DNA 총량(ug)

저장장소

확증표본

곳체두드럭조개

315.619

26

8.206

1XTE pH8.0

O


(2) 기타분석

A. Genome Size estimation – Jellyfish 프로그램


각 대상종을 대상으로 Jellyfish 프로그램으로 Genome size를 예측한 결과는 아래와 같다. 각 분석은 k-mer 값 17mer, 19mer, 21mer를 대상으로 하였고 그것을 통해 예측된 genome의 크기는 Estimation genome size 에 표시되었고, 이를 통해 이번 사업에서 분석한 서열의 양의 coverage는 Genome coverage depth(Coverage Depth)에 표기되었다. 그리고 각 종의 표 아래 그래프는 kmer값 별로 나타난 depth의 예측 그래프로 peak값을 확인할 수 있다.


그림입니다. 원본 그림의 이름: CLP000012080018.bmp 원본 그림의 크기: 가로 908pixel, 세로 584pixel





B. 반복서열

-  시퀀싱이 완료된 샘플 DNA 의 contigs 중 1kb 이상의 contigs의 반복서열을 탐색 (Repeat masking results of DNA contigs)


곳체두드럭조개 (Lamprotula leai)

　

곳체두드럭조개 (Lamprotula leai) 는 1kb 이상의 contig 의 반복서열은 364,771개의 read (672,090,971 bp) 이고, GC level 은 34.79% 입니다. Repeat Masking 으로 나온 반복서열은 991,467 bp (전체의 0.15%) 만큼 있다. Small RNA 은 1,667개 read (101,856 bp) 이 있다.

sequences: 364,771

　

total length: 672,090,971 bp (672,090,971 bp excl N/X-runs)

　

GC level : 34.79%

　

bases masked: 991,467 bp ( 0.15%)

　

　

number of

elements

length

occupied

percentage

of sequence

 

SINEs: 

276

20,242 bp

0.00%

 

　

ALUs 

0

0 bp

0.00%

 

　

MIRs 

205

15,643 bp

0.00%

 

LINEs: 

2,844

675,419 bp

0.10%

 

　

LINE1 

186

 11,835 bp

0.00%

 

　

LINE2 

300

 28,679 bp

0.00%

 

　

L3/CR1 

325

222,66 bp

0.00%

 

LTRelements: 

223

170,58 bp

0.00%

 

　

ERVL 

22

 1,322 bp

0.00%

 

　

ERVL-MaLRs

12

627 bp

0.00%

 

　

ERV_classI 

114

7,432 bp

0.00%

 

　

ERV_classII

26

 1,472 bp

0.00%

 

DNAelements: 

1,884

155,964 bp

0.02%

 

　

hAT-Charlie 

648

 59,670 bp

0.01%

 

　

TcMar-Tigger

332

 30,046 bp

0.02%

 

Unclassified: 

34

0,365 bp

0.00%

 

Total interspersed repeats:

　

871,048 bp

0.13%

 

Small RNA:

1,667

101,856 bp

0.02%

 

Satellites:

287

19,025 bp

0.00%

 

 

C. Mito-genome Map

그림입니다. 원본 그림의 이름: 2016_Mito_mapping-곳체두드럭조개.jpg 원본 그림의 크기: 가로 3792pixel, 세로 1176pixel 사진 찍은 날짜: 2016년 11월 27일 오후 2:11 프로그램 이름 : Adobe Photoshop CC (Windows) 색 대표 : sRGB

곳체두드럭조개는 Reference로 16,530 bp 크기의 Lamprotula leai 미토콘드리아 genome을 이용하여 맵핑하였다. 갭은 1,496 bp 가 나왔고, Coverage 는 90.9%로 확인되었다.

D. Transcriptome data 분석

-  곳체두드럭조개

그림입니다. 원본 그림의 이름: CLP000012080022.bmp 원본 그림의 크기: 가로 918pixel, 세로 578pixel


곳체두드럭조개의 KOG 결과, “Infomation Storage and Processing” 부분에서 RNA processing and modification (2.4%), transcription (2.3%) 순으로 많이 매칭된다. “Cellular Processes and Signaling” 에서는 signal transduction mechanisms (14.3%)가 가장 많이 매칭된다. 또한 Metabolism에서는 1% 대로 낮게 매칭되고, Multiple Function 은 31.4% 이다.

그림입니다. 원본 그림의 이름: GO_정리본-곳체두드럭조개.jpg 원본 그림의 크기: 가로 4413pixel, 세로 2922pixel 사진 찍은 날짜: 2016년 11월 27일 오후 10:29 프로그램 이름 : Adobe Photoshop CC (Windows) 색 대표 : sRGB


곳체두드럭조개의 GO 결과, Biological Process에서 metabolic process (2,877개), cellular process (2,705개) 순으로 많이 매칭된다. Molecular Function 에서는 binding (4,545개), catalytic activity (2,875개) 순으로 많이 매칭된다. 또한, Cellular Component 부분에서는 cell (1,482개), cell part (1,479개), membrane (1,386개) 순으로 많이 매칭된다.

(4) Microsatellite 후보군

A. SSR statistics


곳체두드럭조개

Repeats

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

Di

0

0

15544

11441

9218

7155

6154

7398

14802

10852

537

Tri

0

11527

6932

5469

7927

2864

88

1

0

0

0

Tetra

11301

5043

6214

2220

13

0

0

0

0

0

0

Penta

901

364

182

0

0

0

0

0

0

0

0

Hexa

211

19

0

0

0

0

0

0

0

0

0

Total

12413

16953

28872

19130

17158

10019

6242

7399

14802

10852

537


→ SSR 검색결과 총 144,377개의 SSR 서열을 확인할 수 있었으며, Di motif 가 83.101개로 가장 많이 존재하는 것을 확인 할 수 있었으며, 이를 기반으로 하여 SSR marker 후보군에 대한 primer 를 1,274개 디자인 하였다.


B. Primer sequence

→ 각 종의 유전자를 분석하여 그 종을 구별할 수 있는 primer를 만든다. primer 의 조건은 Motif 약 4~6개이며, Forward 와 Reverse primer 가 18~22개 정도이고 Tm값이 54.5~55.5 정도가 적당하다.


- 곳체두드럭조개

Sequence

Motif

Forward Primer

Tm

Reverse Primer

83228380

(CATC)4

ACACACACACACACGAAAAC

55.2

AATCTTGTGTTGCCAAAAGTA

55.07

83228590

(TATGG)5

CAACACAACGATAAAGGTCAT

55.18

TTCCATACCATACGATACCAT

54.44

83283779

(TAGA)7

TCTGTGCTGTTATGAGAGGAT

54.95

CCTGCATAATGTGGAAAATAA

55.37

83350392

(CAGGTG)4

AGGAGCCACACTTGTAATATG

54.45

GAATATCGAGACTTGTGCTGT

54.53

83421604

(TGTA)6

TCTCACAAGGTGTAAGTGGAC

55.2

CCATAAATCTGACATCCCTTT

55.67

83476796

(ATGT)4

GTGTGTGTGTGTGTGTGGTAG

55.64

TTTTAATTGGAACCATGTAGC

54.56

83536353

(AGGT)4

GTACCCATTTATTGCATTTGA

55.21

ATCGCTTTTCATCGTGTAGTA

55.18

83600503

(TTTTGT)4

AATGTCTTTGCATGACAAGTT

54.88

GGTCTCTAGCTGACAATGAAA

54.67

83653227

(CCACC)4

TAAAAGAAGACAAACCACCAC

54.46

GCTTAAATCAAGCAAGCATAA

55.17

83711893

(AATA)5

ACCTATCCCCTTCACAACTAT

54.32

CAGAGAGAAGTAGCATCAAACC

55.87

83762141

(TATTTT)4

TAGGATATTTGCGTGAATAGG

54.68

GCTATTGAGACATTGTTCCAG

54.97

83811761

(AAAT)4

CTGTACAGTAATCAGGAAGCAA

54.85

TATTTTGGAACTCAACAGCAT

54.99

83867074

(TGTT)7

CAGGGCTTTTTAATGTATTTG

54.37

CACAGGTACTGGAAAATTTGA

55.32

83867874

(TCAAAA)4

ATGGGTCATACTGGTATTTGA

54.45

AGCAAATTGAGATTCTTGATG

54.62

 

C. 바코드 서열


    요번 16년도에 채집한 11종의 유전자를 분석하여 그 종을 구별할 수 있는 Barcode 서열을 만들었고, 그 Barcode 서열을 가지고 NCBI (National Center for Biotechnology Information) 사이트에 있는 BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)을 이용하여 결과를 확인하였다. 각 종의 서열들의 BLAST 결과 마커로서 주로 사용되는 COI 서열과 매치되는 것으로 보아 바코드 서열로 사용가능할 것으로 사료된다.


 그림입니다. 원본 그림의 이름: CLP000012080006.bmp 원본 그림의 크기: 가로 937pixel, 세로 669pixel  

(5) QC 결과

DNA Library QC

Name

Concentration 

 (ng/ul)

Volume

(ul)

Quantity 

(ug)

Main peak Size (bp)

Result

곳체두드럭조개

91.1

3.27

298.19

470

pass


RNA Library QC

Name

Concentration 

 (ng/ul)

Volume

(ul)

Quantity 

(ng)

Main peak Size (bp)

Result

곳체두드럭조개

71.25

5.25

374.12

298

Pass


(6) Gene prediction

샘플종

Number of  Contig (>1kb)

Number of Bases (>1kb)

N50 Contig Size

Number of gene prediction

곳체두드럭조개

364,771

672,090,971

1,903

109,512


각종별로 transcriptome 서열을 대상으로 1kb 이상만을 선택하여 Gene predcition 한 결과 위의 매칭된 contig, base 수는 위의 표와 같고 N50되는 Contig의 길이도 보통 1~3kb 정도로 나타났다. 그리고 이들을 통해 예측된 유전자의 수는 2천개에서 10만개 이상으로 다양하게 예측되었다.


※ Long contig의 Gene prediction 결과 그림 예시

그림입니다. 원본 그림의 이름: CLP000068380006.bmp 원본 그림의 크기: 가로 934pixel, 세로 582pixel