두드럭조개 (Lamprotula coreana)

그림입니다. 원본 그림의 이름: -.jpg 원본 그림의 크기: 가로 1698pixel, 세로 1422pixel 사진 찍은 날짜: 2007년 12월 03일, 오후 4:40

▣ 국    명 : 두드럭조개

▣ 학    명 : Lamprotula coreana (Martens, 1886)

▣ 지정번호 : 멸종위기 야생생물 Ⅰ급

 ▣ 계    통 : 연체동물문 > 이매패강 > 석패목 > 석패과
> 두드럭조개속

◎ 형 태 : 각장 45 mm, 각고 40 mm. 패각은 둥글고 담수 이매패류 중 가장 두껍고 단단한 패각을 갖는다. 각피는 황색 바탕에 흑갈색을 띠고 과립상의 굵은 돌기가 껍질의 뒤쪽에 특히 많이 나타난다. 각정은 앞 쪽으로 치우쳐 있고 앞쪽 등선 아래는 직선상으로 배선에 연결된다. 패각 내면은 백색의 연한 자주색이다. 주치와 후측치는 왼쪽 껍질에 2개, 오른쪽 껍질에 주치가 3개, 측치가 1개씩 있다.


◎ 생 태 : 수심이 깊고 유속이 높으며 하상에 모래와 자갈이 혼합된 곳에 서식한다. 자웅이체이며 10월에서 다음해 4월에 글로키디움을 방출하는 동계 산란형이다. 유생은 glochidium으로 방출되어 어류 등의 숙주에 기생 생활을 거친 후 유패로 변태한다.


◎ 분 포 : 금강 지역


① 채집정보

- 채 집 자: 강원대학교 이준상

- 채집지역: 충청남도 금산군 제원면 천내리 일대


묶음 개체입니다.

◆ 포획위치 : 금산군 천내리 일대

 

  그림입니다. 원본 그림의 이름: 충남 금산군 제원면 천내리_2.jpg 원본 그림의 크기: 가로 960pixel, 세로 720pixel

◆ 서식지 환경

   

 그림입니다. 원본 그림의 이름: 두드럭조개.JPG 원본 그림의 크기: 가로 4288pixel, 세로 3216pixel 사진 찍은 날짜: 2016년 08월 03일 오후 12:46 카메라 제조 업체 : PENTAX 카메라 모델 : PENTAX Optio WG-1 프로그램 이름 : Optio WG-1 Ver 1.00 F-스톱 : 4.6 노출 시간 : 1/160초 IOS 감도 : 80 색 대표 : sRGB 노출 모드 : 자동 35mm 초점 거리

◆ 포획한 두드럭조개 3개체


② 채집현황 및 샘플처리

두드럭조개 채집현황

샘플처리

채집일

개체 수

DNAseq

RNAseq

표본

2016.07.29

3 EA

2 EA

1 EA

-


③ 기존 NCBI Taxonomy 유전정보 현황

유전정보 종류

Lamprotula 속 유전자원

Lamprotula coreana 유전자원

Nucleotide

210

30

Protein

280

29

Genome

6

1

Gene

127

13


④ Sequencing 결과

두드럭조개

Type

Total Reads

Total Bases

Total Bases (Gb)

GC Rate

비고

DNA seq

277,629,844 

41,922,106,444 

41.9 

35.6 

 

RNA seq

77,373,658 

7,814,739,458 

7.8 

42.5 

 

 - Illumina DNA Sequncing 결과

SOAP de novo

LC-DNA hiseq

Input information

　

　

　

Region1

Region2

Total

raw data

Number Of Reads

 

 

138,814,922

138,814,922

277,629,844

Number Of Bases

 

 

20,961,053,222

20,961,053,222

41,922,106,444

error correction

Number Of Reads

 

 

138,306,819

135,904,178

274,210,997

Number Of Bases

 

 

20,585,461,708

19,678,470,444

40,263,932,152

pair reads

Number Of Reads

 

 

 

271,385,608

271,385,608

Number Of Bases

 

 

 

39,882,892,577

39,882,892,577

single reads

Number Of Reads

 

 

 

2,825,389

2,825,389

Number Of Bases

 

 

 

381,039,575

381,039,575

Assembly Results

Scaffold Metrics

> 1 bp*

> 100 bp

> 500 bp**

> 1000 bp

> 2000 bp

Number Of Scaffolds

 

3,623,201

643,092

306,974

97,622

Number Of Bases

 

1,367,530,675

825,732,596

588,962,850

298,123,292

Avg. Scaffold Size

 

377

1,284

1,918

3,053

N50 Scaffold Size

 

776

1,523

2,017

3,014

N80 Scaffold Size

 

193

827

1,329

2,323

N90 Scaffold Size

 

131

652

1,156

2,150

largest Scaffold Size

 

22,696

22,696

22,696

22,696

Contig Metrics

> 1 bp*

> 100 bp

> 500 bp**

> 1000 bp

> 2000 bp

Number Of Contigs

31,682,529

3,623,201

643,092

306,974

97,622

Number Of Bases

2,633,147,009

1,367,530,675

825,732,596

588,962,850

298,123,292

Avg. Contig Size

83

377

1,284

1,918

3,053

N50 Contig Size

109

776

1,523

2,017

3,014

N80 Contig Size

39

193

827

1,329

2,323

N90 Contig Size

35

131

652

1,156

2,150

Largest Contig Size

22,696

22,696

22,696

22,696

22,696

 - Illumina RNA Sequncing 결과

Total number of raw reads

- Number of sequences

77,373,658

- Number of bases

7,814,739,458

Contig information

- Total number of  contig

50,607

- Number of bases

52,650,133

- Mean length of contig (bp)

1,040.3

- N50 length of contig (bp)

1,477

- GC % of contig

37.34

- Largest contig (bp)

31,416

- No. of large contigs (≥500bp)

126,231

Unigene information

- Total number of  unigenes

71,798

- Number of bases

98,731,274

- Mean length of unigene (bp)

1,375.1

- N50 length of unigene (bp)

2,243

- GC % of unigene

36.7

- Length ranges (bp)

224 – 25,876

 

2) 현재 상황에 대한 고찰

나) 자생 동물자원 Genome Survey

(1) 고품질 genomic DNA 채취 및 표본확보

- 검수용 DNA는 대부분 만족하였고 멸종위기종인 대상종들은 채집량의 제한으로 인해 확증표본으로 제출가능한 표본을 확보하지 못하여 사진으로 대처하고자 함.


검수용  샘플 DNA 농도 및 총 양, 확증표본 현황표

Sample 명

농도(ng/ul)

Volume(ul)

DNA 총량(ug)

저장장소

확증표본

두드럭조개

126.527

28

3.543

1XTE pH8.0

사진으로대체


(2) 기타분석

A. Genome Size estimation – Jellyfish 프로그램


각 대상종을 대상으로 Jellyfish 프로그램으로 Genome size를 예측한 결과는 아래와 같다. 각 분석은 k-mer 값 17mer, 19mer, 21mer를 대상으로 하였고 그것을 통해 예측된 genome의 크기는 Estimation genome size 에 표시되었고, 이를 통해 이번 사업에서 분석한 서열의 양의 coverage는 Genome coverage depth(Coverage Depth)에 표기되었다. 그리고 각 종의 표 아래 그래프는 kmer값 별로 나타난 depth의 예측 그래프로 peak값을 확인할 수 있다.



그림입니다. 원본 그림의 이름: CLP000012080017.bmp 원본 그림의 크기: 가로 908pixel, 세로 587pixel






B. 반복서열

-  시퀀싱이 완료된 샘플 DNA 의 contigs 중 1kb 이상의 contigs의 반복서열을 탐색 (Repeat masking results of DNA contigs)


두드럭조개(Lamprotula coreana)

　

두드럭조개(Lamprotula coreana) 는 1kb 이상의 contig 의 반복서열은 306,974개의 read (588,962,850 bp) 이고, GC level 은 34.16% 이다. Repeat Masking 으로 나온 반복서열은 813,957 bp (전체의 0.14%) 만큼 있다. Small RNA 은 1,368개 read (83,423 bp) 이 있다.

sequences: 306,974

　

total length: 588,962,850 bp (588,962,850 bp excl N/X-runs)

　

GC level : 34.16%

　

bases masked: 813,957 bp ( 0.14%)

　

　

number of

elements

length

occupied

percentage

of sequence

 

SINEs: 

284

19,183 bp

0.00%

 

　

ALUs 

0

0bp

0.00%

 

　

MIRs 

199

14,049 bp

0.00%

 

LINEs: 

2,421

513,969 bp

0.09%

 

　

LINE1 

169

10,686 bp

0.00%

 

　

LINE2 

229

20,145 bp

0.00%

 

　

L3/CR1 

246

16,365 bp

0.00%

 

LTRelements: 

165

12,903 bp

0.00%

 

　

ERVL 

11

592 bp

0.00%

 

　

ERVL-MaLRs

6

328 bp

0.00%

 

　

ERV_classI 

85

6,260 bp

0.00%

 

　

ERV_classII

26

1,446 bp

0.00%

 

DNAelements: 

1,830

168,386 bp

0.03%

 

　

hAT-Charlie 

545

 58,611 bp

0.01%

 

　

TcMar-Tigger

299

31,545 bp

0.01%

 

Unclassified: 

20

1,093 bp

0.00%

 

Total interspersed repeats:

　

715,534 bp

0.12%

 

Small RNA:

1,368

83,423 bp

0.01%

 

Satellites:

235

15,373 bp

0.00%

 

 



C. Mito-genome Map

그림입니다. 원본 그림의 이름: 2016_Mito_mapping-두드럭조개.jpg 원본 그림의 크기: 가로 3816pixel, 세로 1180pixel 사진 찍은 날짜: 2016년 11월 27일 오후 2:11 프로그램 이름 : Adobe Photoshop CC (Windows) 색 대표 : sRGB

두드럭조개는 Reference로 15,697 bp 크기의 Lamprotula coreana 미토콘드리아 genome을 이용하여 맵핑하였다. 갭은 1,708 bp 가 나왔고, Coverage 는 89.1%로 확인되었다. 

D. Transcriptome data 분석

-  두드럭조개

그림입니다. 원본 그림의 이름: CLP000012080021.bmp 원본 그림의 크기: 가로 912pixel, 세로 578pixel


두드럭조개의 KOG 결과, “Infomation Storage and Processing” 부분에서 transcription (2.3%), RNA processing and modification (2%) 순으로 많이 매칭된다. “Cellular Processes and Signaling” 에서 signal transduction mechanisms (15.2%) 가 가장 많이 매칭된다. 또한 Metabolism 에서는 1% 대로 낮게 매칭되고, Multiple Function 은 30 % 이다.

그림입니다. 원본 그림의 이름: GO_정리본-두드럭조개.jpg 원본 그림의 크기: 가로 4413pixel, 세로 2915pixel 사진 찍은 날짜: 2016년 11월 27일 오후 10:29 프로그램 이름 : Adobe Photoshop CC (Windows) 색 대표 : sRGB


두드럭조개의 GO 결과, Biological Process에서 cellular process (4,562개), metabolic process (4,334개) 순으로 많이 매칭된다. Molecular Function 에서는 binding (7,948개), catalytic activity (4,313개) 순으로 많이 매칭된다. 또한, Cellular Component 부분에서는 membrane (2,217개), cell (2,136개), cell part (2,133개) 순으로 많이 매칭된다.

(4) Microsatellite 후보군

A. SSR statistics


두드럭조개

Repeats

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

Di

0

0

12562

8662

6387

5515

5651

9422

23778

16020

651

Tri

0

10314

5638

4680

9417

4239

157

0

0

0

0

Tetra

9757

4381

6856

3063

30

0

0

0

0

0

0

Penta

722

403

270

0

0

0

0

0

0

0

0

Hexa

179

19

0

0

0

0

0

0

0

0

0

Total

10658

15117

25326

16405

15834

9754

5808

9422

23778

16020

651


→ SSR 검색결과 총 148,773개의 SSR 서열을 확인할 수 있었으며, Di motif 가 88,648개로 가장 많이 존재하는 것을 확인 할 수 있었으며, 이를 기반으로 하여 SSR marker 후보군에 대한 primer 를 1,049개 디자인 하였다.


B. Primer sequence

→ 각 종의 유전자를 분석하여 그 종을 구별할 수 있는 primer를 만든다. primer 의 조건은 Motif 약 4~6개이며, Forward 와 Reverse primer 가 18~22개 정도이고 Tm값이 54.5~55.5 정도가 적당하다.


- 두드럭조개

Sequence

Motif

Forward Primer

Tm

Reverse Primer

62752037

(CCACGA)4

TCGTTAATCTCTCCAATGAAA

55.05

CACTACTGGTAGGCAAAGAAA

54.84

62789653

(TGCTAT)4

ATCTTCCTTCCTTCTCATTTG

55.12

GGCCAACATCTCTTACATAAA

54.52

62831174

(TTGG)7

CAAAGGTTTTATCCACTTTGA

54.59

GATCCAATTTCCTCAGCAT

55

62871592

(AGGGGG)4

GTAAAAGTTCCCCTGTCCTTA

55.09

GTGAATAAAATGGTTCCATCA

55

62905158

(GCCACC)4

CAGAGAGAAAACGTAAAATGC

54.48

TATTTACGCCTGACTAAAACG

54.99

62943753

(TAAT)6

CTAAACATGAAGGGCATACTG

55.04

CATTTAAGAAGCTGTCGTCAT

54.74

62984802

(AATCTC)4

TCTCAATTCCAATCTGACACT

54.74

TTGAGGTTGATACTGAGAGTGA

55.02

63018464

(GTAG)4

TGATGGATCGTAGATGAGTTT

54.72

CACATCGTTCATCTGACAATA

54.52

63057244

(ATTT)4

GTACTTGCACCCATTTTGTAG

54.95

ATGCTGCTTGAGCTTTATGTA

55.5

63094730

(TTAT)4

TGGGACTATTTTATGAGCAAA

55.1

TGTAAGCCAACTGGATAAAAC

54.61

63132429

(ACCCTG)4

ACCCTAAGAAAACAGACCTTG

55.15

CAGACTCAGGGTTAGGGATAG

55.51

63169447

(ATTGTC)4

CACGGATATAAAGTGGGTTACT

55.03

TAACATGTTTACGGAAGAAGC

54.77

63202817

(TTTA)4

GAAAGATCTGTGCACACTAACA

55.56

TATTGAATCAGGGTGTACTGG

55.11

63239029

(TACC)7

TCTATCGATTTCCTTAACGTG

54.7

TGAAAAGAGAAAACGAACAAG

54.92

 

C. 바코드 서열


    요번 16년도에 채집한 11종의 유전자를 분석하여 그 종을 구별할 수 있는 Barcode 서열을 만들었고, 그 Barcode 서열을 가지고 NCBI (National Center for Biotechnology Information) 사이트에 있는 BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)을 이용하여 결과를 확인하였다. 각 종의 서열들의 BLAST 결과 마커로서 주로 사용되는 COI 서열과 매치되는 것으로 보아 바코드 서열로 사용가능할 것으로 사료된다.


그림입니다. 원본 그림의 이름: CLP000012080005.bmp 원본 그림의 크기: 가로 937pixel, 세로 665pixel

(5) QC 결과

DNA Library QC

Name

Concentration 

 (ng/ul)

Volume

(ul)

Quantity 

(ug)

Main peak Size (bp)

Result

두드럭조개

73.87

3.27

241.81

470

pass


RNA Library QC

Name

Concentration 

 (ng/ul)

Volume

(ul)

Quantity 

(ng)

Main peak Size (bp)

Result

두드럭조개

71.31

5.34

380.92

288

Pass


(6) Gene prediction

샘플종

Number of  Contig (>1kb)

Number of Bases (>1kb)

N50 Contig Size

Number of gene prediction

두드럭조개

306,974

588,962,850

2,017

91,223


각종별로 transcriptome 서열을 대상으로 1kb 이상만을 선택하여 Gene predcition 한 결과 위의 매칭된 contig, base 수는 위의 표와 같고 N50되는 Contig의 길이도 보통 1~3kb 정도로 나타났다. 그리고 이들을 통해 예측된 유전자의 수는 2천개에서 10만개 이상으로 다양하게 예측되었다.


※ Long contig의 Gene prediction 결과 그림 예시

그림입니다. 원본 그림의 이름: CLP000068380006.bmp 원본 그림의 크기: 가로 934pixel, 세로 582pixel