울릉도달팽이 (Karaftohelix adamsi)
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▣ 국 명 : 울릉도달팽이 ▣ 학 명 : Karaftohelix adamsi Kuroda & Hukuda, 1944 ▣ 지정번호 : 멸종위기 야생생물 Ⅱ급 ▣ 계 통 : 연체동물문 > 복족강 > 진유폐목 > 달팽이과 |
◎ 형 태 : 각고 9 mm, 각경 14 mm. 나층은 4.5층이고 체색은 적갈색이다. 체층 주연에 둔한 각이 있고 그 각을 따라 한 줄의 진한 적갈색 띠가 체층을 두르고 있다. 굵은 성장맥이 패각 전체에 나 있다. 제공은 좁고 깊으며 각구는 경사져 있고 저순 부위가 편평한 난형이며 약간 퍼진다.
◎ 생 태 : 자웅동체이며 수정된 난은 한 번에 산란하고 발생은 직접 이루어진다. 숲 속의 습기 높은 관목림 밑이나 나무 위에 서식한다.
◎ 분 포 : 한국 특산종이며 울릉도가 모식 산지이다.
① 채집정보
- 채 집 자: 강원대학교 이준상
- 채집지역: 경상북도 울릉군 성인봉 일대
② 채집현황 및 샘플처리
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울릉도달팽이 채집현황 |
샘플처리 |
|||
|
채집일 |
개체 수 |
DNAseq |
RNAseq |
표본 |
|
2016.08.25 |
2 EA |
1 EA |
1 EA |
- |
③ 기존 NCBI Taxonomy 유전정보 현황
|
유전정보 종류 |
Karaftohelix 속 유전자원 |
Karaftohelix adamsi 유전자원 |
|
Nucleotide |
61 |
- |
|
Protein |
10 |
- |
④ Sequencing 결과
|
울릉도달팽이 |
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|
Type |
Total Reads |
Total Bases |
Total Bases (Gb) |
GC Rate |
비고 |
|
DNA seq |
301,367,732 |
37,972,334,232 |
38.0 |
- |
|
|
RNA seq |
72,798,798 |
9,172,648,548 |
9.2 |
- |
|
- Illumina DNA Sequncing 결과
|
SOAP de novo |
|||||
|
KA-DNA hiseq |
|||||
|
Input information |
|||||
|
|
|
|
Region1 |
Region2 |
Total |
|
raw data |
|||||
|
Number Of Reads |
|
|
150,683,866 |
150,683,866 |
301,367,732 |
|
Number Of Bases |
|
|
18,986,167,116 |
18,986,167,116 |
37,972,334,232 |
|
error correction |
|||||
|
Number Of Reads |
|
|
145,215,767 |
143,526,128 |
288,741,895 |
|
Number Of Bases |
|
|
17,165,231,480 |
16,821,247,935 |
33,986,479,415 |
|
pair reads |
|||||
|
Number Of Reads |
|
|
|
280,695,668 |
280,695,668 |
|
Number Of Bases |
|
|
|
33,171,264,113 |
33,171,264,113 |
|
single reads |
|||||
|
Number Of Reads |
|
|
|
8,046,227 |
8,046,227 |
|
Number Of Bases |
|
|
|
815,215,302 |
815,215,302 |
|
Assembly Results |
|||||
|
Scaffold Metrics |
> 1 bp* |
> 100 bp |
> 500 bp** |
> 1000 bp |
> 2000 bp |
|
Number Of Scaffolds |
2,864,610 |
2,864,610 |
702,012 |
154,765 |
10,959 |
|
Number Of Bases |
1,080,542,080 |
1,080,542,080 |
586,172,615 |
212,714,185 |
27,364,546 |
|
Avg. Scaffold Size |
377 |
377 |
834 |
1,374 |
2,496 |
|
N50 Scaffold Size |
540 |
540 |
844 |
1,331 |
2,364 |
|
N80 Scaffold Size |
287 |
287 |
610 |
1,106 |
2,115 |
|
N90 Scaffold Size |
153 |
153 |
552 |
1,050 |
2,055 |
|
largest Scaffold Size |
26,600 |
26,600 |
26,600 |
26,600 |
26,600 |
|
Contig Metrics |
> 1 bp* |
> 100 bp |
> 500 bp** |
> 1000 bp |
> 2000 bp |
|
Number Of Contigs |
53,121,597 |
4,575,747 |
134,014 |
5,603 |
180 |
|
Number Of Bases |
2,958,625,374 |
878,101,771 |
87,975,412 |
7,444,288 |
1,003,710 |
|
Avg. Contig Size |
55 |
191 |
656 |
1,328 |
5,576 |
|
N50 Contig Size |
51 |
202 |
630 |
1,190 |
8,088 |
|
N80 Contig Size |
35 |
127 |
541 |
1,056 |
2,895 |
|
N90 Contig Size |
34 |
112 |
519 |
1,024 |
2,345 |
|
Largest Contig Size |
26,600 |
26,600 |
26,600 |
26,600 |
26,600 |
- Illumina RNA Sequncing 결과
|
Total number of raw reads |
|
|
- Number of sequences |
72,798,798 |
|
- Number of bases |
9,172,648,548 |
|
Contig information |
|
|
- Total number of contig |
247,039 |
|
- Number of bases |
113,912,872 |
|
- Mean length of contig (bp) |
461 |
|
- N50 length of contig (bp) |
479 |
|
- GC % of contig |
42 |
|
- Largest contig (bp) |
12,388 |
|
- No. of large contigs (≥500bp) |
60,078 |
|
Unigene information |
|
|
- Total number of unigenes |
51,683 |
|
- Number of bases |
36,127,974 |
|
- Mean length of unigene (bp) |
699 |
|
- N50 length of unigene (bp) |
887 |
|
- GC % of unigene |
42 |
|
- Length ranges (bp) |
224 – 13,102 |
2) 현재 상황에 대한 고찰
나) 자생 동물자원 Genome Survey
(1) 고품질 genomic DNA 채취 및 표본확보
- 검수용 DNA는 대부분 만족하였고 멸종위기종인 대상종들은 채집량의 제한으로 인해 확증표본으로 제출가능한 표본을 확보하지 못하여 사진으로 대처하고자 함.
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검수용 샘플 DNA 농도 및 총 양, 확증표본 현황표 |
|||||
|
Sample 명 |
농도(ng/ul) |
Volume(ul) |
DNA 총량(ug) |
저장장소 |
확증표본 |
|
울릉도달팽이 |
171.4 |
79.91 |
13.7 |
1XTE pH8.0 |
사진으로대체 |
(2) 기타분석
A. Genome Size estimation – Jellyfish 프로그램
각 대상종을 대상으로 Jellyfish 프로그램으로 Genome size를 예측한 결과는 아래와 같다. 각 분석은 k-mer 값 17mer, 19mer, 21mer를 대상으로 하였고 그것을 통해 예측된 genome의 크기는 Estimation genome size 에 표시되었고, 이를 통해 이번 사업에서 분석한 서열의 양의 coverage는 Genome coverage depth(Coverage Depth)에 표기되었다. 그리고 각 종의 표 아래 그래프는 kmer값 별로 나타난 depth의 예측 그래프로 peak값을 확인할 수 있다.
B. 반복서열
- 시퀀싱이 완료된 샘플 DNA 의 contigs 중 1kb 이상의 contigs의 반복서열을 탐색 (Repeat masking results of DNA contigs)
|
울릉도달팽이(Karaftohelix adamsi) |
|
울릉도달팽이 (Karaftohelix adamsi) 는 1kb 이상의 contig 의 반복서열은 4,605개 read (6,217,408 bp) 이고, GC level 은 39.06% 이다. Repeat Masking 으로 나온 반복서열은 5,127 bp (전체의 0.08%) 만큼 있다. Small RNA 은 9개 read (624 bp) 이 있다. |
||||
|
sequences: 4,605 |
|
|||||
|
total length: 6,217,408 bp (6,217,408 bp excl N/X-runs) |
|
|||||
|
GC level : 39.06% |
|
|||||
|
bases masked: 5,127 bp ( 0.08%) |
|
|||||
|
|
number of elements |
length occupied |
percentage of sequence |
|
||
|
SINEs: |
1 |
50 bp |
0.00% |
|
||
|
|
ALUs |
0 |
0 bp |
0.00% |
|
|
|
|
MIRs |
0 |
0 bp |
0.00% |
|
|
|
LINEs: |
13 |
1,732 bp |
0.03% |
|
||
|
|
LINE1 |
1 |
55 bp |
0.00% |
|
|
|
|
LINE2 |
1 |
51 bp |
0.00% |
|
|
|
|
L3/CR1 |
4 |
195 bp |
0.00% |
|
|
|
LTRelements: |
3 |
181 bp |
0.00% |
|
||
|
|
ERVL |
0 |
0 bp |
0.00% |
|
|
|
|
ERVL-MaLRs |
0 |
0 bp |
0.00% |
|
|
|
|
ERV_classI |
1 |
62 bp |
0.00% |
|
|
|
|
ERV_classII |
1 |
44 bp |
0.00% |
|
|
|
DNAelements: |
22 |
2,436 bp |
0.04% |
|
||
|
|
hAT-Charlie |
7 |
755 bp |
0.01% |
|
|
|
|
TcMar-Tigger |
9 |
979 bp |
0.02% |
|
|
|
Unclassified: |
0 |
0 bp |
0.00% |
|
||
|
Total interspersed repeats: |
|
4,399 bp |
0.07% |
|
||
|
Small RNA: |
9 |
624 bp |
0.01% |
|
||
|
Satellites: |
2 |
104 bp |
0.00% |
|
||
|
|
||||||
C. Mito-genome Map
울릉도달팽이는 Reference로 14,039 bp 크기의 Aegista diversifamilia 미토콘드리아 genome을 이용하여 맵핑하였다. 갭은 633 bp 가 나왔고, Coverage 는 95.5%로 확인되었다.
D. Transcriptome data 분석
- 울릉도달팽이
울릉도달팽이의 KOG 결과, “Infomation Storage and Processing” 부분에서 transcription (4.9%), replication/recombination/repair (4.5%) 순으로 많이 매칭된다. “Cellular Processes and Signaling” 에서는 signal transduction mechanisms 과 post translational modification 이 5.1% 로 가장 많이 매칭된다. 또한 Metabolism 부분에서 amino acid transport and metabolism (2.3%)가 많이 매칭되고, Multiple Function 은 29.4% 이다.
울릉도달팽이의 GO 결과, Biological Process에서 metabolic process (1,049개), cellular process (824개) 순으로 많이 매칭된다. Molecular Function 에서는 binding (1,708개), catalytic activity (1,162개) 순으로 많이 매칭된다. 또한, Cellular Component 부분에서는 membrane (474개), cell (462개), cell part (458개) 순으로 많이 매칭된다.
(4) Microsatellite 후보군
A. SSR statistics
|
울릉도달팽이 |
||||||||||
|
Repeats |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
9 |
10 |
11 |
12 |
13 |
|
Di |
0 |
0 |
104 |
49 |
33 |
20 |
12 |
26 |
15 |
5 |
|
Tri |
0 |
124 |
51 |
27 |
21 |
4 |
0 |
0 |
0 |
0 |
|
Tetra |
70 |
26 |
17 |
3 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
|
Penta |
10 |
1 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
|
Hexa |
2 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
|
Total |
82 |
151 |
172 |
79 |
54 |
24 |
12 |
26 |
15 |
5 |
→ SSR 검색결과 총 620개의 SSR 서열을 확인할 수 있었으며, Di motif 가 264개로 가장 많이 존재하는 것을 확인 할 수 있었으며, 이를 기반으로 하여 SSR marker 후보군에 대한 primer 를 343개 디자인 하였다.
B. Primer sequence
→ 각 종의 유전자를 분석하여 그 종을 구별할 수 있는 primer를 만든다. primer 의 조건은 Motif 약 4~6개이며, Forward 와 Reverse primer 가 18~22개 정도이고 Tm값이 54.5~55.5 정도가 적당하다.
- 울릉도달팽이
|
Sequence |
Motif |
Forward Primer |
Tm |
|
Reverse Primer |
|||
|
107317884 |
(TTCACT)6 |
GCAACCTCATTAACTCATCTG |
54.97 |
|
CAAGTTTAGTCAGAAGCTTGG |
54.55 |
||
|
107309687 |
(TCACC)5 |
TCTCACCTCACCTCATCATAC |
55.03 |
|
GTGCATTGAGATGCATTGT |
55.38 |
||
|
107310883 |
(TTGTT)5 |
ACACGCAATAACAACAAAGTT |
55.02 |
|
TTGTGCTAAGTGAGAGCAAGT |
55.45 |
||
|
107310979 |
(CTTGT)5 |
AGAAGACAAGCGAAATAAGGT |
54.99 |
|
CAGAGTAATTTCAGACGTCCA |
55.48 |
||
|
107314189 |
(GCGAT)5 |
GATACGATGCGATGATGTG |
55.81 |
|
CCTCTACCCTCTACCGTAAAA |
55.28 |
||
|
107316943 |
(TTGGT)5 |
GGAAAGGTTTAAGGGTTGTAA |
55.1 |
|
ACCAGGATGTATCAAAAGCTC |
55.9 |
||
|
107309333 |
(CTTT)4 |
GAGTTTGGAATCACAACAAGT |
54.24 |
|
GCTCGTGCACCATATAGATAA |
55.55 |
||
|
107309827 |
(CCTG)4 |
GTCCTGTTATTTGTGTGTGTG |
53.88 |
|
CAATAAATCATGCCCTAATGA |
55.3 |
||
|
107309893 |
(TATA)4 |
TACATTTCTTTGCATTCTTGG |
55.57 |
|
ACCTCCTCGTTCTTACAAATC |
55.06 |
||
|
107310321 |
(CACA)4 |
TCTAGTGTTGTGAGGAAGCAT |
55.04 |
|
CAAGGTAAGTTGAAACCATTG |
54.92 |
||
|
107310329 |
(TGTT)4 |
TGTTTGTCAAAACAACTGTGA |
55.18 |
|
ACATGGTGGTTGTCAATGTAG |
55.81 |
||
|
107310451 |
(GTAC)4 |
ACAATGAAGCACTACATCCAG |
55.34 |
|
GTTTTGTACGTGAACCTGTGT |
55.16 |
||
|
107310695 |
(CTAC)4 |
CAGCGACAATAACCAAGTTAC |
55.11 |
|
CAGGTAGGTAGATCGGTAGGT |
54.98 |
C. 바코드 서열
요번 16년도에 채집한 11종의 유전자를 분석하여 그 종을 구별할 수 있는 Barcode 서열을 만들었고, 그 Barcode 서열을 가지고 NCBI (National Center for Biotechnology Information) 사이트에 있는 BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)을 이용하여 결과를 확인하였다. 각 종의 서열들의 BLAST 결과 마커로서 주로 사용되는 COI 서열과 매치되는 것으로 보아 바코드 서열로 사용가능할 것으로 사료된다.
(5) QC 결과
|
DNA Library QC |
|||||
|
Name |
Concentration (ng/ul) |
Volume (ul) |
Quantity (ug) |
Main peak Size (bp) |
Result |
|
울릉도달팽이 |
171.43 |
79.91 |
13.7 |
500 |
pass |
|
RNA Library QC |
|||||
|
Name |
Concentration (ng/ul) |
Volume (ul) |
Quantity (ng) |
Main peak Size (bp) |
Result |
|
울릉도달팽이 |
180 |
6.2 |
29 |
318 |
Pass |
(6) Gene prediction
|
샘플종 |
Number of Contig (>1kb) |
Number of Bases (>1kb) |
N50 Contig Size |
Number of gene prediction |
|
울릉도달팽이 |
4,605 |
6,217,408 |
1,195 |
2,291 |
각종별로 transcriptome 서열을 대상으로 1kb 이상만을 선택하여 Gene predcition 한 결과 위의 매칭된 contig, base 수는 위의 표와 같고 N50되는 Contig의 길이도 보통 1~3kb 정도로 나타났다. 그리고 이들을 통해 예측된 유전자의 수는 2천개에서 10만개 이상으로 다양하게 예측되었다.
※ Long contig의 Gene prediction 결과 그림 예시
