산굴뚝나비 (Hipparchia autonoe)

그림입니다.

▣ 국    명 : 산굴뚝나비

▣ 학    명 : Hipparchia autonoe (Esper, 1783)

▣ 지정번호 : 멸종위기 야생생물 Ⅰ급

 ▣ 계    통 : 절지동물문 > 곤충강 > 나비목 > 네발나비과
> 산굴뚝나비속

◎ 형 태 : 날개 편 길이는 45~55 mm 정도이다. 머리와 몸은 흑갈색이며, 날개의 바탕색도 흑갈색을 띤다. 양 날개의 외횡선을 따라 바깥쪽으로 번지는 황백색의 띠무늬가 있으며, 앞날개에 백색의 안점이 있는 2개의 흑색 눈알모양 무늬가 있고, 뒷날개의 내연각 부근에도 조그마한 1개의 눈알모양무늬가 있다. 암컷은 수컷에 비하여 일반적으로 크고 날개의 바탕색이 연하다.

◎ 생 태 : 남한에서는 한라산 1,400 m 부터 암석이 노출된 곳에 살며, 정상의 건조한 초지에 개체수가 적지 않다. 특히 한라산 윗세오름에서 백록담에 이르는 건조한 풀밭에 많다. 수컷은 화산암 위에 앉아 쉬고 있을 때가 많은데, 바람이 약해지면 고산지대의 솔체꽃, 송이풀, 꿀풀 등의 꽃에서 꿀을 빤다.  화산암에서 자주 휴식을 취하고 양지바른 곳의 풀밭이나 관목 위를 천천히 비행하는 것을 관찰할 수 있으며, 바람이 불면 멀리 나나 보통 한 번 날아도 5~6 m 정도 날아가 뚝 떨어지듯이 내려앉는다. 암컷은 먹이식물의 잎에 알을 한 개씩 낳아 붙인다. 애벌레로 월동한다.


◎ 분 포 : 국내에는 제주도 한라산 1400 m 이상 고지, 국외에는 중국, 극동 러시아, 유럽 등

① 채집 정보

- 채 집 자: 빛고을생태연구소 정헌천

- 채집지역: 한라산 천연보호구역 장구목 일대


묶음 개체입니다.

◆ 산굴뚝나비 성충

   

   

        그림입니다. 원본 그림의 이름: 20160727_213909.jpg 원본 그림의 크기: 가로 4128pixel, 세로 3096pixel 사진 찍은 날짜: 2016년 07월 27일 오후 9:39 카메라 제조 업체 : SAMSUNG 카메라 모델 : SHV-E330S 프로그램 이름 : E330SKSUDOL4 F-스톱 : 2.2 노출 시간 : 1/421초 IOS 감도 : 50 색 대표 : sRGB 노출 모드 : 자동 35mm 초점 거리 : 31

◆ 포획한 산굴뚝나비 성충 4개체


② 채집현황 및 샘플처리

산굴뚝나비 채집현황

샘플처리

채집일

개체 수

DNAseq

RNAseq

표본

2016.07.29

4 EA

2 EA

2 EA

-


③ 기존 NCBI Taxonomy 유전정보 현황

유전정보 종류

Hipparchia 속 유전자원

Hipparchia autonoe 유전자원

Nucleotide

373

111

Protein

360

96

Genome

1

1

Gene

13

13


④ Sequencing 결과

 

산굴뚝나비

Type

Total Reads

Total Bases

Total Bases (Gb)

GC Rate

비고

DNA seq

240,779,012 

36,357,630,812 

36.4 

37.2 

 

RNA seq

72,190,452 

7,291,235,652 

7.3 

44.6 

 

 

 - Illumina DNA Sequncing 결과

SOAP de novo

HA-DNA hiseq

Input information

　

　

　

Region1

Region2

Total

raw data

Number Of Reads

 

 

120,389,506

120,389,506

240,779,012

Number Of Bases

 

 

18,178,815,406

18,178,815,406

36,357,630,812

error correction

Number Of Reads

 

 

119,792,221

117,504,939

237,297,160

Number Of Bases

 

 

17,865,202,317

17,052,267,774

34,917,470,091

pair reads

Number Of Reads

 

 

 

234,704,726

234,704,726

Number Of Bases

 

 

 

34,565,893,304

34,565,893,304

single reads

Number Of Reads

 

 

 

2,592,434

2,592,434

Number Of Bases

 

 

 

351,576,787

351,576,787

Assembly Results

Scaffold Metrics

> 1 bp*

> 100 bp

> 500 bp**

> 1,000 bp

> 2,000 bp

Number Of Scaffolds

 

883,724

115,987

58,729

30,699

Number Of Bases

 

350,637,767

210,540,041

171,454,057

132,041,266

Avg. Scaffold Size

 

396

1,815

2,919

4,301

N50 Scaffold Size

 

928

2,897

3,715

4,715

N80 Scaffold Size

 

198

1,061

1,843

2,882

N90 Scaffold Size

 

130

709

1,382

2,430

largest Scaffold Size

 

66,311

66,311

66,311

66,311

Contig Metrics

> 1 bp*

> 100 bp

> 500 bp**

> 1,000 bp

> 2,000 bp

Number Of Contigs

14,640,427

1,384,006

101,536

24,308

4,271

Number Of Bases

930,025,799

319,689,476

90,485,766

38,803,399

12,203,386

Avg. Contig Size

63

230

891

1,596

2,857

N50 Contig Size

66

266

892

1,559

2,733

N80 Contig Size

36

135

609

1,168

2,219

N90 Contig Size

34

114

550

1,077

2,103

Largest Contig Size

14,981

14,981

14,981

14,981

14,981

 

] - Illumina RNA Sequncing 결과

Total number of raw reads

- Number of sequences

72,190,452

- Number of bases

7,291,235,652

Contig information

- Total number of contig

161,217

- Number of bases

162,981,105

- Mean length of contig (bp)

1010.9

- N50 length of contig (bp)

1,772

- GC % of contig

40.66

- Largest contig (bp)

28,592

- No. of large contigs (≥500bp)

84,465

Unigene information

- Total number of unigenes

41,602

- Number of bases

66,264,041

- Mean length of unigene (bp)

1592.8

- N50 length of unigene (bp)

2,571

- GC % of unigene

40.79

- Length ranges (bp)

224 – 28,944

 

2) 현재 상황에 대한 고찰

(1) 고품질 genomic DNA 채취 및 표본확보

- 검수용 DNA는 대부분 만족하였고 멸종위기종인 대상종들은 채집량의 제한으로 인해 확증표본으로 제출가능한 표본을 확보하지 못하여 사진으로 대처하고자 함.


검수용  샘플 DNA 농도 및 총 양, 확증표본 현황표

　

Sample 명

농도(ng/ul)

Volume(ul)

DNA 총량(ug)

저장장소

확증표본

1

산굴뚝나비

29.679

68

2.018

1XTE pH8.0

사진으로대체


(2) 기타분석

A. Genome Size estimation – Jellyfish 프로그램


각 대상종을 대상으로 Jellyfish 프로그램으로 Genome size를 예측한 결과는 아래와 같다. 각 분석은 k-mer 값 17mer, 19mer, 21mer를 대상으로 하였고 그것을 통해 예측된 genome의 크기는 Estimation genome size 에 표시되었고, 이를 통해 이번 사업에서 분석한 서열의 양의 coverage는 Genome coverage depth(Coverage Depth)에 표기되었다. 그리고 각 종의 표 아래 그래프는 kmer값 별로 나타난 depth의 예측 그래프로 peak값을 확인할 수 있다.



그림입니다. 원본 그림의 이름: CLP00001208000d.bmp 원본 그림의 크기: 가로 908pixel, 세로 591pixel






B. 반복서열

-  시퀀싱이 완료된 샘플 DNA 의 contigs 중 1kb 이상의 contigs의 반복서열을 탐색 (Repeat masking results of DNA contigs)


산굴뚝나비 (Hipparchia autonoe)

 

산굴뚝나비 (Hipparchia autonoe) 는 1kb 이상의 contig 의 반복서열은 7,838개 read (10,187,681 bp) 이고, GC level 은 32.17%이다. Repeat Masking 으로 나온 반복서열은 111,849 bp (전체의 1.1%) 만큼 있다. Small RNA 은 17개 read (733 bp) 이 있다.

sequences: 7,838

 

total length: 10,187,681 bp (10,187,681 bp excl N/X-runs)

 

GC level: 32.17 %

 

bases masked: 111,849 bp ( 1.10%)

 

　

number of

elements

length

occupied

percentage

of sequence

 

 

SINEs: 

8

526 bp

0.00%

 

　

ALUs 

0

 0 bp

0.00%

 

　

MIRs 

5

318 bp

0.00%

 

LINEs: 

22

2,067 bp

0.01%

 

　

LINE1 

6

302 bp

0.00%

 

　

LINE2 

4

266 bp

0.00%

 

　

L3/CR1 

8

442 bp

0.00%

 

LTRelements: 

7

1,089 bp

0.00%

 

　

ERVL 

1

 59 bp

0.00%

 

　

ERVL-MaLRs

0

 0 bp

0.00%

 

　

ERV_classI 

1

97 bp

0.00%

 

　

ERV_classII

0

 0 bp

0.00%

 

DNAelements: 

35

4,899 bp

0.01%

 

　

hAT-Charlie 

11

 1,430 bp

0.00%

 

　

TcMar-Tigger

6

 1,827 bp

0.00%

 

Unclassified: 

12

1,406 bp

0.00%

 

Total interspersed repeats:

 

9,987 bp

0.03%

 

Small RNA:

17

733 bp

0.00%

 

Satellites:

5

290 bp

0.00%

 



C. Mito-genome Map

그림입니다. 원본 그림의 이름: 2016_Mito_mapping-산굴뚝나비.jpg 원본 그림의 크기: 가로 3792pixel, 세로 1200pixel 사진 찍은 날짜: 2016년 11월 27일 오후 2:09 프로그램 이름 : Adobe Photoshop CC (Windows) 색 대표 : sRGB

산굴뚝나비는 Reference로 15,489 bp 크기의 Hipparchia autonoe 미토콘드리아 genome을 이용하여 맵핑하였다. 갭은 1,240 bp 로, Coverage 는 92.0%로 확인되었다.



D. Transcriptome data 분석

-  산굴뚝나비

그림입니다. 원본 그림의 이름: CLP000012080019.bmp 원본 그림의 크기: 가로 912pixel, 세로 578pixel

산굴뚝나비의 KOG 결과, “Infomation Storage and Processing” 부분에서는 RNA processing and modification 관련과 6.3%로 가장 많이 매칭되고, “Cellular Processes and Signaling” 에서는 signal transduction mechanisms (7.8%), post translational modification (3.8%) 로 많이 매칭된다. “Metabolism” 부분은 평균 1% 대로 낮게 매칭되고, Multiple Function 은 24.7% 이다.

그림입니다. 원본 그림의 이름: GO_정리본-산굴뚝나비.jpg 원본 그림의 크기: 가로 4413pixel, 세로 2931pixel 사진 찍은 날짜: 2016년 11월 27일 오후 10:27 프로그램 이름 : Adobe Photoshop CC (Windows) 색 대표 : sRGB


산굴뚝나비의 GO 결과, Biological Process에서 cellular process (4,571개), metabolic process (4,562개) 순으로 많이 매칭된다. Molecular Function 에서는 binding (7,210개), catalytic activity (4,407개) 순으로 가장 많이 매칭된다. 또한, Cellular Component 부분에서는 membrane (2,623개), cell (2,452개), cell part (2,446개) 순으로 많이 매칭된다.

(4) Microsatellite 후보군

A. SSR statistics

산굴뚝나비

Repeats

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

Di

0

0

300

112

53

34

9

6

5

5

Tri

0

471

123

41

10

6

1

0

0

0

Tetra

596

105

18

9

1

0

0

0

0

0

Penta

117

38

1

0

0

0

0

0

0

0

Hexa

11

1

0

0

0

0

0

0

0

0

Total

724

615

442

162

64

40

10

6

5

5


→ SSR 검색결과 총 2,013개의 SSR 서열을 확인할 수 있었으며, Tetra motif 가 729개로 가장 많이 존재하는 것을 확인 할 수 있었으며, 이를 기반으로 하여 SSR marker 후보군에 대한 primer 를 1,436개 디자인 하였다.



B. Primer sequence

→ 각 종의 유전자를 분석하여 그 종을 구별할 수 있는 primer를 만든다. primer 의 조건은 Motif 약 4~6개이며, Forward 와 Reverse primer 가 18~22개 정도이고 Tm값이 54.5~55.5 정도가 적당하다.


 

- 산굴뚝나비

Sequence

Motif

Forward Primer

Tm

Reverse Primer

29230117

(AGGT)4

ACCTACATAACAGTCAAAACGA

54.14

AGCCTACTCATCGTCACAGTA

55.07

29230235

(AACA)4

TTTTCCGAAATAAAAGGTAGC

55.48

TGCATATATTGTGTGCTTTTG

54.95

29230299

(GTAG)4

ATATACGTGACAGGAAACACG

55.22

GCTATCTTGTGACCGAATAAA

54.68

29230465

(TGAAA)4

CAGTGTCATATGTGCCATGTA

55.39

CCTGAATAGGAGACAGCAATA

54.67

29245907

(AATA)4

GAGATAAGCTGTCCTTGTGC

55.09

TCCAGAACTCTGATAGGTACG

54.56

29246009

(GTAC)4

GCTACGGAAATAACAATGATG

54.96

AGTTTCGAGATCACAGACAGA

54.98

29246111

(TTTA)4

GACGTTGGTATATCGTTTGAT

54.22

GCGTTGGTAGATCAGTCAGT

55.3

29246297

(TGAC)4

ACTAGGGAAAATTGGGTGTAA

55.36

TCTAAATCCACAGTTGGTCTG

55.31

29259255

(TTTG)4

TTTTCTTTCAACCGAATGAT

54.86

ATAATGACCTCGTTATTCTGC

53.64

29259309

(CTGT)4

TATTGCAAATGCGAAAGTAAC

55.74

CCCTATTTCAACCTCTCAAGT

55.07

29259339

(ATAG)4

AACCCCTTTAATAGAGCAAAC

54.43

TGATCGTAGCTATAACCCATC

54.47

29270569

(GTTT)4

TTATGTACTGGCCTAAATCCA

54.98

TTCGCATATATTCCAAGAGTT

54.23

29270839

(AATA)5

TGTTTTCATTTGAGCTATGGT

54.99

TGAAACGATGACGGTTACTAT

54.86

29270877

(ACACA)4

AGTACGCACAGAATCTCTTGA

55.2

AGATTTAGCTTCGCATTTTTC

55.61

 

C. 바코드 서열


    요번 16년도에 채집한 11종의 유전자를 분석하여 그 종을 구별할 수 있는 Barcode 서열을 만들었고, 그 Barcode 서열을 가지고 NCBI (National Center for Biotechnology Information) 사이트에 있는 BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)을 이용하여 결과를 확인하였다. 각 종의 서열들의 BLAST 결과 마커로서 주로 사용되는 COI 서열과 매치되는 것으로 보아 바코드 서열로 사용가능할 것으로 사료된다.


   그림입니다. 원본 그림의 이름: CLP000012082fec.bmp 원본 그림의 크기: 가로 938pixel, 세로 657pixel

(5) QC 결과

DNA Library QC

NO.

Name

Concentration 

 (ng/ul)

Volume

(ul)

Quantity 

(ug)

Main peak Size (bp)

Result

1

산굴뚝나비

87.2

3.27

285.44

470

pass


RNA Library QC

NO.

Name

Concentration 

 (ng/ul)

Volume

(ul)

Quantity 

(ng)

Main peak Size (bp)

Result

1

산굴뚝나비

55.86

5.16

288.38

298

Pass



(6) Gene prediction

샘플종

Number of  Contig (>1kb)

Number of Bases (>1kb)

N50 Contig Size

Number of gene prediction

산굴뚝나비

24,308

38,803,399

1,559

12,633


각종별로 transcriptome 서열을 대상으로 1kb 이상만을 선택하여 Gene predcition 한 결과 위의 매칭된 contig, base 수는 위의 표와 같고 N50되는 Contig의 길이도 보통 1~3kb 정도로 나타났다. 그리고 이들을 통해 예측된 유전자의 수는 2천개에서 10만개 이상으로 다양하게 예측되었다.


※ Long contig의 Gene prediction 결과 그림 예시

그림입니다. 원본 그림의 이름: CLP000068380004.bmp 원본 그림의 크기: 가로 934pixel, 세로 583pixel