멋조롱박딱정벌레 (Damaster mirabilissimus mirabilissimus)

그림입니다.

▣ 국    명 : 멋조롱박딱정벌레

▣ 학    명 : Damaster mirabilissimus mirabilissimus
Ishikawa & Deuve

▣ 지정번호 : 멸종위기 야생생물 Ⅱ급

▣ 계    통 : 절지동물문 > 곤충강 > 딱정벌레목 > 딱정벌레과
> 조롱박딱정벌레속


◎ 형 태 : 몸길이 수컷 23∼25 mm, 암컷 25∼28 mm이다. 몸빛 깔은 매우 화려한데, 어두운 푸른색, 어두운 녹색, 청록색, 어두운 자주색 등의 금속성 광택이 검은색 바탕 위에서 빛난다. 머리가 눈에 띄게 크고, 구기(입틀)가 튼튼하게 발달해 있다. 목이 유난히 굵다. 딱지날개는 긴 타원형이고 그물눈처럼 조각 구조로 돼 있다. 날지 못하는 것은 뒷날개가 퇴화했기 때문이다.


◎ 생 태 : 한국 고유종으로 산지의 원시림에 드물게 서식한다. 유충과 성충은 모두 야행성이며, 달팽이나 지렁이, 나비목의 유충 등을 주로 잡아먹는다.


◎ 분 포 : 중부지방 원시림지대 극히 제한된 지역

① 멋조롱박딱정벌레 채집정보

- 채 집 자: 빛고을생태연구소 정헌천

- 채집지역: 강원도 평창군 진부면 동산리 산 (상원사앞 전나무 숲길)

   묶음 개체입니다.

◆포획한 멋조롱박딱정벌레 성충 2개체


② 채집현황 및 샘플처리

멋조롱박딱정벌레 채집현황

샘플처리

채집일

개체 수

DNAseq

RNAseq

표본

2016.06.19

2 EA

1 EA

1 EA

-


③ 기존 NCBI Taxonomy 유전정보 현황

`유전정보 종류

Genus Damaster 유전자원

Damaster mirabilissimus mirabilissimus 유전자원

Nucleotide

402

2

Protein

395

26

Genome

1

1

Gene

13

13


④ Sequencing 결과

멋조롱박딱정벌레

Type

Total Reads

Total Bases

Total Bases (Gb)

GC Rate

비고

DNA seq

265,230,228 

40,049,764,428 

40.0 

34.8 

 

RNA seq

66,553,052 

10,049,510,852 

10.0 

43.6 

 


 - Illumina DNA Sequncing 결과

SOAP de novo

DM-DNA hiseq

Input information

　

　

　

Region1

Region2

Total

raw data

Number Of Reads

 

 

132,615,114

132,615,114

265,230,228

Number Of Bases

 

 

20,024,882,214

20,024,882,214

40,049,764,428

error correction

Number Of Reads

 

 

131,511,817

128,015,022

259,526,839

Number Of Bases

 

 

19,521,040,843

18,441,036,998

37,962,077,841

pair reads

Number Of Reads

 

 

 

255,643,244

255,643,244

Number Of Bases

 

 

 

37,414,558,156

37,414,558,156

single reads

Number Of Reads

 

 

 

3,883,595

3,883,595

Number Of Bases

 

 

 

547,519,685

547,519,685

Assembly Results

Scaffold Metrics

> 1 bp*

> 100 bp

> 500 bp**

> 1000 bp

> 2000 bp

Number Of Scaffolds

 

182,729

27,526

16,059

10,931

Number Of Bases

 

178,261,025

152,086,295

144,148,167

137,055,031

Avg. Scaffold Size

 

975

5,525

8,976

12,538

N50 Scaffold Size

 

14,949

19,439

20,900

22,227

N80 Scaffold Size

 

1,156

5,554

7,183

8,820

N90 Scaffold Size

 

240

2,037

3,555

5,075

largest Scaffold Size

 

175,593

175,593

175,593

175,593

Contig Metrics

> 1 bp*

> 100 bp

> 500 bp**

> 1000 bp

> 2000 bp

Number Of Contigs

7,027,349

363,618

74,054

39,915

16,690

Number Of Bases

450,397,865

173,451,879

120,684,540

96,530,594

64,006,388

Avg. Contig Size

64

477

1,629

2,418

3,835

N50 Contig Size

56

1,251

2,148

2,725

3,874

N80 Contig Size

35

257

999

1,525

2,579

N90 Contig Size

34

147

728

1,246

2,271

Largest Contig Size

82,858

82,858

82,858

82,858

82,858

 

 - Illumina RNA Sequncing 결과

Total number of raw reads

- Number of sequences

66,553,052

- Number of bases

10,049,510,852

Contig information

- Total number of  contig

188,927

- Number of bases

206,636,027

- Mean length of contig (bp)

1,093.7

- N50 length of contig (bp)

2,244

- GC % of contig

39.59

- Largest contig (bp)

27,961

- No. of large contigs (≥500bp)

92,509

Unigene information

- Total number of  unigenes

48,407

- Number of bases

87,917,588

- Mean length of unigene (bp)

1,816.2

- N50 length of unigene (bp)

3,093

- GC % of unigene

39.65

- Length ranges (bp)

224 – 29,278

 

2) 현재 상황에 대한 고찰

나) 자생 동물자원 Genome Survey

(1) 고품질 genomic DNA 채취 및 표본확보

- 검수용 DNA는 대부분 만족하였고 멸종위기종인 대상종들은 채집량의 제한으로 인해 확증표본으로 제출가능한 표본을 확보하지 못하여 사진으로 대처하고자 함.


검수용  샘플 DNA 농도 및 총 양, 확증표본 현황표

Sample 명

농도(ng/ul)

Volume(ul)

DNA 총량(ug)

저장장소

확증표본

멋조롱박딱정벌레

130.554

66

8.617

1XTE pH8.0

사진으로대체


(2) 기타분석

A. Genome Size estimation – Jellyfish 프로그램


각 대상종을 대상으로 Jellyfish 프로그램으로 Genome size를 예측한 결과는 아래와 같다. 각 분석은 k-mer 값 17mer, 19mer, 21mer를 대상으로 하였고 그것을 통해 예측된 genome의 크기는 Estimation genome size 에 표시되었고, 이를 통해 이번 사업에서 분석한 서열의 양의 coverage는 Genome coverage depth(Coverage Depth)에 표기되었다. 그리고 각 종의 표 아래 그래프는 kmer값 별로 나타난 depth의 예측 그래프로 peak값을 확인할 수 있다.


그림입니다. 원본 그림의 이름: CLP000012080012.bmp 원본 그림의 크기: 가로 908pixel, 세로 596pixel


B. 반복서열

-  시퀀싱이 완료된 샘플 DNA 의 contigs 중 1kb 이상의 contigs의 반복서열을 탐색 (Repeat masking results of DNA contigs)


멋조롱박딱정벌레

(Damaster mirabilissimus mirabilissimus)

　

멋조롱박딱정벌레 (Damaster mirabilissimus mirabilissimus)  는 1kb 이상의 contig 의 반복서열은 3,915개 read (96,530,594 bp) 이고, GC level 은 36.77% 이다. Repeat Masking 으로 나온 반복서열은 56,841 bp (전체의 0.06%) 만큼 있다. Small RNA 은 153개 read (7,308 bp) 이 있다.

sequences: 3,915

　

total length: 96,530,594 bp (96,530,594 bp excl N/X-runs)

　

GC level : 36.77%

　

bases masked: 56,841 bp ( 0.06%)

　

　

number of

elements

length

occupied

percentage

of sequence

 

SINEs: 

12

767 bp

0.00%

 

　

ALUs 

0

 0 bp

0.00%

 

　

MIRs 

1

63 bp

0.00%

 

LINEs: 

56

3,428 bp

0.00%

 

　

LINE1 

14

796 bp

0.00%

 

　

LINE2 

11

556 bp

0.00%

 

　

L3/CR1 

14

1,151 bp

0.00%

 

LTRelements: 

15

1,189 bp

0.00%

 

　

ERVL 

6

401 bp

0.00%

 

　

ERVL-MaLRs

0

0 bp

0.00%

 

　

ERV_classI 

6

353 bp

0.00%

 

　

ERV_classII

0

 0 bp

0.00%

 

DNAelements: 

205

43,636 bp

0.05%

 

　

hAT-Charlie 

89

17,788 bp

0.02%

 

　

TcMar-Tigger

46

9,027 bp

0.01%

 

Unclassified: 

0

0 bp

0.00%

 

Total interspersed repeats:

　

49,020 bp

0.05%

 

Small RNA:

153

7,308 bp

0.01%

 

Satellites:

9

513 bp

0.00%

 

 



C. Mito-genome Map

그림입니다. 원본 그림의 이름: 2016_Mito_mapping-멋조롱박딱정벌레.jpg 원본 그림의 크기: 가로 3824pixel, 세로 1212pixel 사진 찍은 날짜: 2016년 11월 27일 오후 2:09 프로그램 이름 : Adobe Photoshop CC (Windows) 색 대표 : sRGB

멋조롱박딱정벌레는 Reference로 16,823 bp 크기의 Damaster mirabilissimus 미토콘드리아 genome을 이용하여 맵핑하였다. 갭은 2,550 bp 가 나왔고, Coverage 는 84.8%로 확인되었다. 

D. Transcriptome data 분석

-  멋조롱박딱정벌레

그림입니다. 원본 그림의 이름: CLP00001208001f.bmp 원본 그림의 크기: 가로 912pixel, 세로 578pixel


멋조롱박딱정벌레의 KOG 결과, “Infomation Storage and Processing” 부분에서 RNA processing and modification (3.3%), transcription (3.1%) 등이 많이 발현된다. “Cellular Processes and Signaling” 에서는 signal transduction mechanisms (10.9%), post translational modification (4.7%), cytoseleton (4.0%) 등이 많이 매칭된다. 또한 Metabolism 에서는 carbohydrate transport and metabolism (2.5%) 이 많이 매칭되고, Multiple Function 은 23.6% 이다.

그림입니다. 원본 그림의 이름: GO_정리본-멋조롱박딱정벌레.jpg 원본 그림의 크기: 가로 4413pixel, 세로 2931pixel 사진 찍은 날짜: 2016년 11월 27일 오후 10:26 프로그램 이름 : Adobe Photoshop CC (Windows) 색 대표 : sRGB


멋조롱박딱정벌레의 GO 결과, Biological Process에서 metabolic process (5,260개), cellular process (5,099개) 순으로 많이 매칭된다. Molecular Function 에서는 binding (5,065개), catalytic activity (4,898개) 순으로 많이 매칭된다. 또한, Cellular Component 부분에서는 membrane (3,329개), cell (3,099개), cell part (3,069개) 순으로 많이 매칭된다.

(4) Microsatellite 후보군

A. SSR statistics


멋조롱박딱정벌레

Repeats

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

Di

0

0

4651

3116

1917

1040

781

760

1206

1472

428

Tri

0

2136

867

315

90

46

24

3

0

0

0

Tetra

1680

368

98

35

5

0

0

0

0

0

0

Penta

144

23

7

0

0

0

0

0

0

0

0

Hexa

3

9

0

0

0

0

0

0

0

0

0

Total

1827

2536

5623

3466

2012

1086

805

763

1206

1472

428


→ SSR 검색결과 총 21,224개의 SSR 서열을 확인할 수 있었으며, Di motif 가 15,371개로 가장 많이 존재하는 것을 확인 할 수 있었으며, 이를 기반으로 하여 SSR marker 후보군에 대한 primer 를 1,828개 디자인 하였다.

B. Primer sequence

→ 각 종의 유전자를 분석하여 그 종을 구별할 수 있는 primer를 만든다. primer 의 조건은 Motif 약 4~6개이며, Forward 와 Reverse primer 가 18~22개 정도이고 Tm값이 54.5~55.5 정도가 적당하다.


- 멋조롱박딱정벌레

Sequence

Motif

Forward Primer

Tm

Reverse Primer

13974520

(ACAT)4

TTCACCGACTCTATACCTTTG

54.59

ATGCACAGGTTACTCATAGCA

55.96

13975538

(CATA)6

AACTACAAGGACCACACACAC

54.97

TGAAAAACTCTCCACTTACCA

55.03

13986408

(GCAAC)4

GCTCGATAAAAATTACACGAA

54.86

ACATTCTTTCACACACACACA

54.82

13986432

(ATGT)4

GGATTCAGTGATGAGATTGAA

55.09

GTGAACTAGTGCGCTTATGTC

55.24

13997532

(TTTA)6

TGAAAAGGAAAGTTGAGATGA

55.08

CAATACACAACCCAGATAAGC

54.86

13997724

(GTAC)4

ACGACAAGTGAAAAAGCATTA

55.23

ACACACACACACACACACTTC

55.1

14008308

(ACAT)4

CCATGACGTAAAAACAAGGT

55.17

GAACGAAATAAAAAGGTGGAT

55.02

14008602

(TGTT)4

GTATCGCCTAGTTAATGTTGC

54.33

AATGTGTGATGTGAAAGGAAC

54.95

14018664

(CATA)4

TTTCTCAAATCAGTAGCTTGC

55.02

TCGTTTATTCATTGCTATGGT

54.96

14019002

(GAGC)6

ATGTGACGTCATCGTTAAGAG

55.34

ACACTGGCACTTCTTGTCTC

55.34

14028586

(GTTT)4

CCTACAACCATACGATAGTGC

54.9

TTGACCGGTACTGTAGAAGAC

54.46

14028684

(GCAA)6

ACGATGGAGATATTCGTTGTA

54.78

CTCTCTTCGTGTGTGTGTGTA

54.73

14038135

(TACA)4

TCGTAACAAAACAGAAACCAT

54.91

AACAACCTACTCTTGCATTGA

55.05

14048286

(TATC)4

CTTATGTTGTGCCCATAATCT

54.4

AAACATGGATGACATGAGATG

55.78

 

C. 바코드 서열


    요번 16년도에 채집한 11종의 유전자를 분석하여 그 종을 구별할 수 있는 Barcode 서열을 만들었고, 그 Barcode 서열을 가지고 NCBI (National Center for Biotechnology Information) 사이트에 있는 BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)을 이용하여 결과를 확인하였다. 각 종의 서열들의 BLAST 결과 마커로서 주로 사용되는 COI 서열과 매치되는 것으로 보아 바코드 서열로 사용가능할 것으로 사료된다.



   그림입니다. 원본 그림의 이름: CLP000012080001.bmp 원본 그림의 크기: 가로 920pixel, 세로 682pixel


(5) QC 결과

DNA Library QC

Name

Concentration 

 (ng/ul)

Volume

(ul)

Quantity 

(ug)

Main peak Size (bp)

Result

멋조롱박딱정벌레

26.15

3.27

85.6

470

pass


RNA Library QC

Name

Concentration 

 (ng/ul)

Volume

(ul)

Quantity 

(ng)

Main peak Size (bp)

Result

멋조롱박딱정벌레

71.53

5.15

368.05

299

Pass


(6) Gene prediction

샘플종

Number of  Contig (>1kb)

Number of Bases (>1kb)

N50 Contig Size

Number of gene prediction

멋조롱박딱정벌레

37,784

52,940,062

1,337

27,379


각종별로 transcriptome 서열을 대상으로 1kb 이상만을 선택하여 Gene predcition 한 결과 위의 매칭된 contig, base 수는 위의 표와 같고 N50되는 Contig의 길이도 보통 1~3kb 정도로 나타났다. 그리고 이들을 통해 예측된 유전자의 수는 2천개에서 10만개 이상으로 다양하게 예측되었다.


※ Long contig의 Gene prediction 결과 그림 예시

그림입니다. 원본 그림의 이름: CLP000068380005.bmp 원본 그림의 크기: 가로 952pixel, 세로 583pixel