물방개 (Cybister japonicus)
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▣ 국 명 : 물방개 ▣ 학 명 : Cybister japonicus Sharp, 1873 ▣ 지정번호 : 멸종위기 야생생물 관찰종 ▣ 계 통 : 절지동물문 > 곤충강 > 딱정벌레목 > 물방개과 |
◎ 형 태 : 몸길이는 약 3.5~4.5 cm 정도의 둥근 타원형으로 납작하다. 앞과 뒤는 약간 뾰족하나 가운데는 솟아 있다. 등딱지는 흑록색 내지 청록색이며 금색 옆줄이 있고 수컷은 등 전체가 매끈하고 광택이 있는 반면 암컷은 가늘고 짧은 줄 모양의 홈이 파여져 있어 광택이 약하다. 머리 방패와 더듬이 등 여타 신체 구조는 황갈색을 띤다. 다리는 전체적으로 검은색을 띤다.
◎ 생 태 : 물방개(문화어: 기름도치)는 한국에 서식하는 물방개과의 곤충 중 가장 큰 종이다. 한자어로는 용슬(龍蝨) 또는 지별충(地鱉蟲)이라고 한다. 아시아와 북아메리카 지역의 물가에서 흔히 서식하는 진수서군곤충으로, 호흡을 위해 꽁무니를 물 밖에 내밀고 산소를 얻거나 물에 있는 산소를 얻는다. 공기 방울을 딱지날개와 등판 사이에 있는 공간 속에 저장할 수도 있다. 다리에는 털이 있으며 특히 뒷다리에 많아 뒷다리로 물속에서 헤엄치거나 자맥질할 추진력을 얻는다. 붙들려 있으려는 습성이 있어 그물에 딸려 붙기도 하며 서로 엉겨 붙어서 헤엄을 치기도 한다. 육식성으로, 민물조류는 먹지 않고 여러 수서곤충들이나 물벼룩, 소형 어류인 송사리를 잡아먹기도 한다. 천적은 대형 민물고기 등이 있으며 그에게서 도망치기 위해 머리 뒤쪽에서 악취를 띤 물질을 분비해 달아나기도 한다.
물방개의 어른벌레는 씹는 턱(저작형 구기)을 가지고 있지만, 물방개의 애벌레는 수서노린재 종류들과 비슷하지만 추가로 씹는 형태의 입(저작 흡수형 구기)을 가지고 있다. 애벌레는 송장헤엄치개처럼 사냥용 독액을 주입하므로 물리면 아프다.
◎ 분 포 : 제주도를 포함한 전국, 중국, 일본, 타이완
① 채집정보
- 채 집 자: 빛고을생태연구소 정헌천
- 채집지역: 제주시 구좌읍 덕천리 일대
◆ 물방개 유충
◆ 물방개 성충
◆ 채집한 물방개 성충 5개체
② 채집현황 및 샘플처리
|
물방개 채집현황 |
샘플처리 |
|||
|
채집일 |
개체 수 |
DNAseq |
RNAseq |
표본 |
|
2016.04.10 |
5 EA |
2 EA |
2 EA |
1 EA |
③ 기존 NCBI Taxonomy 유전정보 현황
|
유전정보 종류 |
Cybister 속 유전자원 |
Cybister japonicus 유전자원 |
|
Nucleotide |
280 |
6 |
|
Protein |
254 |
6 |
④ Sequencing 결과
|
물방개 |
|||||
|
Type |
Total Reads |
Total Bases |
Total Bases (Gb) |
GC Rate |
비고 |
|
DNA seq |
227,608,982 |
34,368,956,282 |
34.4 |
35.7 |
|
|
RNA seq |
67,545,778 |
10,199,412,478 |
10.1 |
42.7 |
|
- Illumina DNA Sequncing 결과
|
SOAP de novo |
|||||
|
CJ-DNA hiseq |
|||||
|
Input information |
|||||
|
|
|
|
Region1 |
Region2 |
Total |
|
raw data |
|||||
|
Number Of Reads |
|
|
113,804,491 |
113,804,491 |
227,608,982 |
|
Number Of Bases |
|
|
17,184,478,141 |
17,184,478,141 |
34,368,956,282 |
|
error correction |
|||||
|
Number Of Reads |
|
|
106,568,600 |
104,358,715 |
210,927,315 |
|
Number Of Bases |
|
|
13,754,443,332 |
13,135,731,772 |
26,890,175,104 |
|
pair reads |
|||||
|
Number Of Reads |
|
|
|
200,332,982 |
200,332,982 |
|
Number Of Bases |
|
|
|
25,783,221,289 |
25,783,221,289 |
|
single reads |
|||||
|
Number Of Reads |
|
|
|
10,594,333 |
10,594,333 |
|
Number Of Bases |
|
|
|
1,106,953,815 |
1,106,953,815 |
|
Assembly Results |
|||||
|
Scaffold Metrics |
> 1 bp* |
> 100 bp |
> 500 bp** |
> 1000 bp |
> 2000 bp |
|
Number Of Scaffolds |
|
1,473,894 |
366,499 |
134,997 |
27,588 |
|
Number Of Bases |
|
603,568,071 |
386,008,723 |
223,946,616 |
79,141,399 |
|
Avg. Scaffold Size |
|
409 |
1,053 |
1,658 |
2,868 |
|
N50 Scaffold Size |
|
730 |
1,134 |
1,645 |
2,771 |
|
N80 Scaffold Size |
|
290 |
709 |
1,202 |
2,243 |
|
N90 Scaffold Size |
|
135 |
595 |
1,095 |
2,111 |
|
largest Scaffold Size |
|
21,840 |
21,840 |
21,840 |
21,840 |
|
Contig Metrics |
> 1 bp* |
> 100 bp |
> 500 bp** |
> 1000 bp |
> 2000 bp |
|
Number Of Contigs |
50,894,527 |
2,796,891 |
99,318 |
10,827 |
758 |
|
Number Of Bases |
2,532,652,700 |
531,655,356 |
72,425,862 |
14,593,422 |
1,970,042 |
|
Avg. Contig Size |
49 |
190 |
729 |
1,347 |
2,599 |
|
N50 Contig Size |
43 |
195 |
704 |
1,278 |
2,494 |
|
N80 Contig Size |
35 |
124 |
564 |
1,084 |
2,154 |
|
N90 Contig Size |
34 |
110 |
530 |
1,039 |
2,067 |
|
Largest Contig Size |
7,684 |
7,684 |
7,684 |
7,684 |
7,684 |
- Illumina RNA Sequncing 결과
|
Total number of raw reads |
|
|
- Number of sequences |
34,212,445 |
|
- Number of bases |
10,199,412,478 |
|
Contig information |
|
|
- Total number of contig |
174,853 |
|
- Number of bases |
135,271,568 |
|
- Mean length of contig (bp) |
773.6 |
|
- N50 length of contig (bp) |
1,337 |
|
- GC % of contig |
36.34 |
|
- Largest contig (bp) |
26,683 |
|
- No. of large contigs (≥500bp) |
67,473 |
|
Unigene information |
|
|
- Total number of unigenes |
42,002 |
|
- Number of bases |
53,393,904 |
|
- Mean length of unigene (bp) |
1,271.2 |
|
- N50 length of unigene (bp) |
2,075 |
|
- GC % of unigene |
36.2 |
|
- Length ranges (bp) |
224 – 26,683 |
2) 현재 상황에 대한 고찰
나) 자생 동물자원 Genome Survey
(1) 고품질 genomic DNA 채취 및 표본확보
- 검수용 DNA는 대부분 만족하였고 멸종위기종인 대상종들은 채집량의 제한으로 인해 확증표본으로 제출가능한 표본을 확보하지 못하여 사진으로 대처하고자 함.
|
검수용 샘플 DNA 농도 및 총 양, 확증표본 현황표 |
|||||
|
Sample 명 |
농도(ng/ul) |
Volume(ul) |
DNA 총량(ug) |
저장장소 |
확증표본 |
|
물방개 |
35.844 |
90 |
3.226 |
1XTE pH8.0 |
O |
(2) 기타분석
A. Genome Size estimation – Jellyfish 프로그램
각 대상종을 대상으로 Jellyfish 프로그램으로 Genome size를 예측한 결과는 아래와 같다. 각 분석은 k-mer 값 17mer, 19mer, 21mer를 대상으로 하였고 그것을 통해 예측된 genome의 크기는 Estimation genome size 에 표시되었고, 이를 통해 이번 사업에서 분석한 서열의 양의 coverage는 Genome coverage depth(Coverage Depth)에 표기되었다. 그리고 각 종의 표 아래 그래프는 kmer값 별로 나타난 depth의 예측 그래프로 peak값을 확인할 수 있다.
B. 반복서열
- 시퀀싱이 완료된 샘플 DNA 의 contigs 중 1kb 이상의 contigs의 반복서열을 탐색 (Repeat masking results of DNA contigs)
|
물방개(Cybister japonicus) |
|
물방개 (Cybister japonicus) 는 1kb 이상의 contig 의 반복서열은 10,827개 read (14,593,422 bp) 이고, GC level 은 32.81% 이다. Repeat Masking 으로 나온 반복서열은 24,649 bp (전체의 0.17%) 만큼 있다. Small RNA 은 28개 read (3,625 bp) 이 있다. |
||||
|
sequences: 10,827 |
|
|||||
|
total length: 14,593,422 bp (14,593,422 bp excl N/X-runs) |
|
|||||
|
GC level : 32.81% |
|
|||||
|
bases masked: 24,649 bp ( 0.17%) |
|
|||||
|
|
number of elements |
length occupied |
percentage of sequence |
|
||
|
SINEs: |
1 |
8 bp |
0.00% |
|
||
|
|
ALUs |
0 |
0 bp |
0.00% |
|
|
|
|
MIRs |
0 |
0 bp |
0.00% |
|
|
|
LINEs: |
25 |
1,527 bp |
0.01% |
|
||
|
|
LINE1 |
2 |
112 bp |
0.00% |
|
|
|
|
LINE2 |
3 |
142 bp |
0.00% |
|
|
|
|
L3/CR1 |
12 |
748 bp |
0.01% |
|
|
|
LTRelements: |
1 |
52 bp |
0.00% |
|
||
|
|
ERVL |
0 |
0 bp |
0.00% |
|
|
|
|
ERVL-MaLRs |
0 |
0 bp |
0.00% |
|
|
|
|
ERV_classI |
1 |
52 bp |
0.00% |
|
|
|
|
ERV_classII |
0 |
0 bp |
0.00% |
|
|
|
DNAelements: |
91 |
19,276 bp |
0.13% |
|
||
|
|
hAT-Charlie |
13 |
2,913 bp |
0.02% |
|
|
|
|
TcMar-Tigger |
10 |
1,876 bp |
0.01% |
|
|
|
Unclassified: |
0 |
0 bp |
0.00% |
|
||
|
Total interspersed repeats: |
|
20,863 bp |
0.14% |
|
||
|
Small RNA: |
28 |
3,625 bp |
0.02% |
|
||
|
Satellites: |
3 |
161 bp |
0.00% |
|
||
|
|
||||||
C. Mito-genome Map
물방개는 Reference로 14,257 bp 크기의 Aspidytes niobe 미토콘드리아 genome을 이용하여 맵핑하였다. 갭은 285 bp 가 나왔고, Coverage 는 98.0%로 확인되었다.
D. Transcriptome data 분석
- 물방개
물방개의 KOG 결과, “Infomation Storage and Processing” 부분에서 replication/recombination/repair (2.6%) 가 가장 높으며 “Cellular Processes and Signaling” 에서는 signal transduction mechanisms (5%), post translational modification (2.2%) 등이 많이 매칭된다. 또한 Metabolism 부분에서는 1% 대로 낮게 발현되고, Multiple Function 은 47.9% 이다.
물방개의 GO 결과로는 Biological Process에서 metabolic process (3,141개), cellular process (2,974개) 순으로 많이 매칭된다. Molecular Function 에서는 binding (3,280개), catalytic activity (3,017개) 순으로 많이 매칭된다. 또한, Cellular Component 부분에서는 membrane (2,315개), cell (1,803개), cell part (1,779개) 순으로 많이 매칭된다.
(4) Microsatellite 후보군
A. SSR statistics
|
물방개 |
|||||||||||
|
Repeats |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
9 |
10 |
11 |
12 |
13 |
14 |
|
Di |
0 |
0 |
132 |
70 |
44 |
18 |
7 |
8 |
4 |
5 |
6 |
|
Tri |
0 |
152 |
61 |
16 |
9 |
1 |
1 |
0 |
0 |
0 |
0 |
|
Tetra |
87 |
23 |
7 |
1 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
|
Penta |
25 |
3 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
|
Hexa |
7 |
2 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
|
Total |
119 |
180 |
200 |
87 |
53 |
19 |
8 |
8 |
4 |
5 |
6 |
→ SSR 검색결과 총 689개의 SSR 서열을 확인할 수 있었으며, Di motif 가 294개로 가장 많이 존재하는 것을 확인 할 수 있었으며, 이를 기반으로 하여 SSR marker 후보군에 대한 primer 를 427개 디자인 하였다.
B. Primer sequence
→ 각 종의 유전자를 분석하여 그 종을 구별할 수 있는 primer를 만든다. primer 의 조건은 Motif 약 4~6개이며, Forward 와 Reverse primer 가 18~22개 정도이고 Tm값이 54.5~55.5 정도가 적당하다.
- 물방개
|
Sequence |
Motif |
Forward Primer |
Tm |
|
Reverse Primer |
|||
|
101775550 |
(TTGTTA)6 |
CCTGCAGTTATAACACATTTT |
52.26 |
|
TTGGCATAAAACAGAACAAT |
53.37 |
||
|
101761236 |
(AAATA)5 |
CAGGTGTACGTATTTTGTGCT |
55.46 |
|
TTGGAAGTTGAAATCTAATCG |
54.66 |
||
|
101765543 |
(ATATA)5 |
TTCCAAGATTGGATGTACAAA |
55.66 |
|
CGAAATTCTCTTTTATTGTGC |
54.44 |
||
|
101766602 |
(TTAGT)5 |
GAGTTTAGAAAAATATAGCACGA |
52.77 |
|
TTTGTGGAGAGAAGAAAAATCT |
54.95 |
||
|
101766926 |
(TATAC)5 |
GCACTGTCTATGAGTTTAATGC |
54.36 |
|
TAACGGCCATTATTAACAACA |
55.87 |
||
|
101767887 |
(ACGGT)5 |
ACGAGTATTACTGCAGATTGG |
54.61 |
|
GAGCTATGTTTGTTTGACGAG |
55.22 |
||
|
101767891 |
(ACACC)5 |
GCAGCAAGTAGTAGGCAGTAG |
54.77 |
|
CACAGTAGAGCATAGCAGAGC |
55.57 |
||
|
101771155 |
(AAATT)5 |
ACTTCTTATCCGGAAACTACC |
54.24 |
|
GGGAAAGTCAAAAGGTAAGAA |
55.21 |
||
|
101771303 |
(AAATT)5 |
TGTTGCCTCATTACTAAATCA |
53.56 |
|
AAATGATGCAAAAGAGACTGA |
55.1 |
||
|
101772650 |
(ATTTC)5 |
GTCCTCCGGTTAGACTCTATT |
54.19 |
|
ACACAACATTTAGCATGGAAT |
54.69 |
||
|
101772784 |
(ATTTA)5 |
GACAAAAAGTAGGAAGACAAGG |
54.91 |
|
TGGAAACTCCAGTGACAAATA |
55.74 |
||
|
101773204 |
(AAAAT)5 |
AAAAATTCCAACGGATACTGT |
55.35 |
|
TACGTATAGCCATCGGAGTAA |
55.16 |
||
|
101773876 |
(ATTAG)5 |
TAAGGATGGTTGTTCATGATT |
54.58 |
|
ATGTTGAACGAGTCAAAGGTA |
54.89 |
||
|
101774104 |
(ATTTT)5 |
CAATACTAAAAAGCCGACGTA |
54.99 |
|
TGTAAATCATTCGTAGTTGCAT |
55.05 |
C. 바코드 서열
요번 16년도에 채집한 11종의 유전자를 분석하여 그 종을 구별할 수 있는 Barcode 서열을 만들었고, 그 Barcode 서열을 가지고 NCBI (National Center for Biotechnology Information) 사이트에 있는 BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)을 이용하여 결과를 확인하였다. 각 종의 서열들의 BLAST 결과 마커로서 주로 사용되는 COI 서열과 매치되는 것으로 보아 바코드 서열로 사용가능할 것으로 사료된다.
(5) QC 결과
|
DNA Library QC |
|||||
|
Name |
Concentration (ng/ul) |
Volume (ul) |
Quantity (ug) |
Main peak Size (bp) |
Result |
|
물방개 |
61.89 |
3.27 |
202.6 |
470 |
pass |
|
RNA Library QC |
|||||
|
Name |
Concentration (ng/ul) |
Volume (ul) |
Quantity (ng) |
Main peak Size (bp) |
Result |
|
물방개 |
58.48 |
5.46 |
319.02 |
282 |
Pass |
(6) Gene prediction
|
샘플종 |
Number of Contig (>1kb) |
Number of Bases (>1kb) |
N50 Contig Size |
Number of gene prediction |
|
물방개 |
10,827 |
14,593,422 |
1,278 |
4,551 |
각종별로 transcriptome 서열을 대상으로 1kb 이상만을 선택하여 Gene predcition 한 결과 위의 매칭된 contig, base 수는 위의 표와 같고 N50되는 Contig의 길이도 보통 1~3kb 정도로 나타났다. 그리고 이들을 통해 예측된 유전자의 수는 2천개에서 10만개 이상으로 다양하게 예측되었다.
※ Long contig의 Gene prediction 결과 그림 예시
