애기뿔소똥구리 Copris tripartitus (Waterhouse,1875)
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▣ 국 명 : 애기뿔소똥구리 ▣ 학 명 : Copris tripartitus Waterhouse,1875 ▣ 지정번호 : 멸종위기 야생생물 Ⅱ급 ▣ 계 통 : 절지동물문 > 곤충강 > 딱정벌레목 > 소똥구리과 > 뿔소똥구리속 |
◎ 형 태 : 뿔소똥구리와 유사하게 동그란 공 모양이지만 크기가 훨씬 작고 광택이 많이 난다. 몸길이는 13~19mm이다. 수컷은 이마에 상아 모양의 뿔이 있다. 암컷은 판 모양의 가로 융기가 있으며 그 양끝에 작은 돌기가 있다. 딱지날개에는 홈이 빗살처럼 여러 개 패어 있다. 앞가슴등판 앞쪽에는 돌기가 뚜렷하게 솟아나 있다. 앞다리 종아리마디 바깥쪽으로 이빨모양의 돌기가 4개 있다.
◎ 생 태 : 4월부터 10월 사이에 소를 방목하는 초지에서 관찰된다. 한여름 이전에 주로 활동한다. 소똥이나 말똥 밑에 굴을 파고 공처럼 생긴 경단을 만들어 알을 낳는다. 유충은 어미가 만들어준 경단 안에서 소똥을 먹으면서 성장한다. 경단이 깨져서 유충이 노출되었을 때에는 거의 살아남지 못한다. 성충이나 유충이 주로 초식동물의 배설물을 먹이로 영양분을 섭취 소화하면서, 식물이나 박테리아가 직접 이용할 수 있도록 잔류 유기물을 환원시켜주므로, 자연의 청소부 역할을 수행한다. 소를 키우는 농촌에서 흔히 볼 수 있었지만, 소를 키우는 방식이 변하고, 풀 대신 사료를 먹이면서 급격히 개체수가 줄고 있다. 사료를 먹은 소의 똥은 섬유질이 부족해 성충이나 유충의 먹이로 적합하지 않으며, 소에게 먹인 항생제 성분이 유충의 성장을 방해하기 때문이다.
◎ 분 포 : 한국의 도서지역, 중국 , 일본
① 채집정보
- 채 집 자 : 빛고을생태연구소 정헌천
- 채집지역 : 제주도 서귀포시
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애기뿔소똥구리 서식지 및 포획장소 환경 |
채집한 애기뿔소똥구리 2개체 |
② 채집현황 및 샘플처리
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애기뿔소똥구리 채집현황 |
샘플처리 |
|||
|
채집일 |
개체 수 |
DNAseq |
RNAseq |
표본 |
|
2017.06.29 |
2 EA |
1 EA |
1 EA |
ㅡ |
③ NCBI Taxonomy 유전정보 현황
|
유전정보 종류 |
Copris 속 유전자원 |
Copris tripartitus 유전자원 |
|
Nucleotide |
363 |
214 |
|
Protein |
260 |
145 |
④ Sequencing 결과
|
Type |
Total Reads |
Total Bases |
Total Bases (Gb) |
GC Rate |
비고 |
|
DNA |
230,300,584 |
34,775,388,184 |
34.7 |
34.1 |
|
|
RNA |
51,207,282 |
7,157,952,349 |
7.1 |
40.5 |
|
- Illumina DNA Sequencing 결과
|
SOAP de novo |
|||||
|
Ct_DNA hiseq |
|||||
|
Input information |
|||||
|
|
|
|
Region1 |
Region2 |
Total |
|
raw data |
|||||
|
Number Of Reads |
|
|
115,150,292 |
115,150,292 |
230,300,584 |
|
Number Of Bases |
|
|
17,387,694,092 |
17,387,694,092 |
34,775,388,184 |
|
error correction |
|||||
|
Number Of Reads |
|
|
112,190,395 |
109,590,230 |
221,780,625 |
|
Number Of Bases |
|
|
16,377,027,942 |
15,372,679,091 |
31,749,707,033 |
|
pair reads |
|||||
|
Number Of Reads |
|
|
|
218,309,484 |
218,309,484 |
|
Number Of Bases |
|
|
|
31,312,049,972 |
31,312,049,972 |
|
single reads |
|||||
|
Number Of Reads |
|
|
|
3,471,141 |
3,471,141 |
|
Number Of Bases |
|
|
|
437,657,061 |
437,657,061 |
|
Assembly Results |
|||||
|
Scaffold Metrics |
> 100 bp |
> 500 bp |
> 1000 bp |
> 2000 bp |
|
|
Number Of Scaffold |
|
1,033,513 |
266,640 |
139,233 |
55,632 |
|
Number Of Bases |
|
536,328,299 |
386,967,698 |
297,388,159 |
179,734,179 |
|
Avg. Scaffold Size |
|
518 |
1,451 |
2,135 |
3,230 |
|
N50 Scaffold Size |
|
1,210 |
1,861 |
2,353 |
3,238 |
|
N80 Scaffold Size |
|
332 |
919 |
1,452 |
2,414 |
|
N90 Scaffold Size |
|
166 |
690 |
1,214 |
2,196 |
|
Largest Scaffold Size |
|
18,277 |
18,277 |
18,277 |
18,277 |
|
Contigs |
> 0 bp |
> 100 bp |
> 500 bp |
> 1000 bp |
> 2000 bp |
|
Number Of Contigs |
29,926,342 |
1,822,102 |
172,461 |
60,819 |
11,474 |
|
Number Of Bases |
1,726,058,535 |
457,428,636 |
174,201,021 |
96,994,701 |
30,019,555 |
|
Avg. Contig Size |
57 |
251 |
1,010 |
1,594 |
2,616 |
|
N50 Contig Size |
57 |
316 |
1,095 |
1,600 |
2,534 |
|
N80 Contig Size |
36 |
136 |
682 |
1,196 |
2,175 |
|
N90 Contig Size |
34 |
114 |
583 |
1,092 |
2,083 |
|
largest Contig Size |
13,569 |
13,569 |
13,569 |
13,569 |
13,569 |
- Illumina RNA Sequencing 결과
|
Total number of raw reads |
|
|
- Number of sequences |
51,207,282 |
|
- Number of bases |
7,157,952,349 |
|
Contig information |
|
|
- Total number of contig |
151,177 |
|
- Number of bases |
127,555,512 |
|
- Mean length of contig (bp) |
843.7 |
|
- N50 length of contig (bp) |
1,593 |
|
- GC % of contig |
37.97 |
|
- Largest contig (bp) |
42,685 |
|
- No. of large contigs (≥500bp) |
61,572 |
|
Transdecoder information |
|
|
- Total number of contig |
101,352 |
|
- Number of bases |
141,178,205 |
|
- Mean length of contig (bp) |
1392.9 |
|
- N50 length of contig (bp) |
2,469 |
|
- GC % of contig |
38.72 |
|
- Largest contig (bp) |
42,685 |
|
- No. of large contigs (≥500bp) |
63,406 |
|
Unigene information |
|
|
- Total number of unigenes |
25,057 |
|
- Number of bases |
45,071,628 |
|
- Mean length of unigene (bp) |
1,798.8 |
|
- N50 length of unigene (bp) |
2,667 |
|
- GC % of unigene |
38.54 |
|
- Length ranges (bp) |
224 - 43,765 |
2) 현재 상황에 대한 고찰
가) 대상종 및 시료확보 상황
(1) 초기 예비종을 포함한 채집 대상종 : 23종(절지동물(곤충) 9종, 연체동물 8종, 양서류 6종)
(2) 채집 완료 종 : 9종(절지동물(곤충) 5종, 연체동물 1종, 양서류 3종)
나) 멸종위기동물의 Genome survey
(1) Library QC data
- DNA Library QC
|
Delivery name |
Tape Concentration (ng/ul) |
Volume (ul) |
Tape Quantity (ug) |
Main peak Size (bp) |
Result |
|
애기뿔소똥구리 |
117.699 |
21 |
2.472 |
470 |
pass |
|
|
- RNA Library QC
|
Delivery name |
Tape Concentration (ng/ul) |
Volume (ul) |
Tape Quantity (ug) |
Main peak Size (bp) |
Result |
|
애기뿔소똥구리 |
336.694 |
30 |
10.101 |
283 |
pass |
|
|
(2) 고품질 genomic DNA 채취 및 표본확보
- 검수용 DNA는 대부분 만족하였고, 멸종위기종인 대상종들은 채집량의 제한으로 인해 확증표본으로 제출 가능한 표본을 확보하지 못하여 사진으로 대체하고자 함.
|
검수용 샘플 DNA 농도 및 총 양 현황표 |
||||||
|
Sample 명 |
농도(ng/ul) |
Volume(ul) |
DNA 총량(ug) |
O.D A260/280 |
추출일자 |
저장장소 |
|
애기뿔소똥구리 |
715 |
300 |
214.5 |
1.92 |
170927 |
1XTE pH8.0 |
(3) 기타분석
A. Genome Size estimation – Jellyfish 프로그램
각 대상종을 대상으로 Jellyfish 프로그램으로 Genome size를 예측한 결과는 아래와 같다. 각 분석은 k-mer 값 17mer, 19mer, 21mer를 대상으로 하였고 그것을 통해 예측된 genome의 크기는 Estimation genome size 에 표시되었고, 이를 통해 이번 사업에서 분석한 서열의 양의 coverage는 Genome coverage depth(Coverage Depth)에 표기되었다. 그리고 각 종의 표 아래 그래프는 kmer값 별로 나타난 depth의 예측 그래프로 peak값을 확인할 수 있다.
|
샘플명 |
K-mer (K-mersize) |
Estimateddepth (K-merCoveragedepth) |
Genomecoveragedepth (Coveragedepth) |
Estimatedgenome size |
|
애기뿔소똥구리 |
17 |
22 |
24.61 |
706,604,064.5 |
|
19 |
21 |
23.84 |
729,285,182.7 |
|
|
21 |
21 |
24.21 |
718,318,488.2 |
B. 반복서열
- 시퀀싱이 완료된 샘플 DNA 의 contigs 중 1kb 이상의 contigs의 반복서열을 탐색 (Repeat masking results of DNA contigs)
|
애기뿔소똥구리 (Copris tripartitus) |
|
애기뿔소똥구리 (Copris tripartitus) 는 1kb 이상의 contig 의 반복서열은 25,106개 read (45,071,628 bp) 이고, GC level 은 38.54%이다. Repeat Masking 으로 나온 반복서열은 549,473 bp (전체의 1.22%) 만큼 있다. Small RNA 은 15개 read (6,491 bp) 가 있고, Simple repeat 는 8,082개 read (348,595 bp) 가 있다. |
||||
|
sequences: 25,106 |
|
|||||
|
total length: 45,071,628 bp (45,071,628 bp excl N/X-runs) |
|
|||||
|
GC level: 38.54 % |
|
|||||
|
bases masked: 549,473 bp ( 1.22%) |
|
|||||
|
|
number of elements |
length occupied |
percentage of sequence |
|
||
|
|
||||||
|
SINEs: |
4 |
201 bp |
0.00% |
|
||
|
|
ALUs |
0 |
0 bp |
0.00% |
|
|
|
|
MIRs |
2 |
88 bp |
0.00% |
|
|
|
LINEs: |
55 |
6,960 bp |
0.02% |
|
||
|
|
LINE1 |
7 |
372 bp |
0.00% |
|
|
|
|
LINE2 |
5 |
340 bp |
0.00% |
|
|
|
|
L3/CR1 |
29 |
2,346 bp |
0.01% |
|
|
|
LTRelements: |
28 |
9,901 bp |
0.02% |
|
||
|
|
ERVL |
1 |
46 bp |
0.00% |
|
|
|
|
ERVL-MaLRs |
0 |
0 bp |
0.00% |
|
|
|
|
ERV_classI |
7 |
911 bp |
0.00% |
|
|
|
|
ERV_classII |
0 |
0 bp |
0.00% |
|
|
|
DNAelements: |
320 |
80,947 bp |
0.18% |
|
||
|
|
hAT-Charlie |
135 |
34,337 bp |
0.08% |
|
|
|
|
TcMar-Tigger |
89 |
24,442 bp |
0.05% |
|
|
|
Unclassified: |
1 |
86 bp |
0.00% |
|
||
|
Total interspersed repeats: |
|
98,095 bp |
0.22% |
|
||
|
Small RNA: |
15 |
6,491 bp |
0.01% |
|
||
|
Satellites: |
0 |
0 bp |
0.00% |
|
||
|
Simple repeats: |
8,082 |
348,595 bp |
0.77% |
|
||
C. Mito-genome Map
애기뿔소똥구리는 Reference로 14,891 bp 크기의 Meropathus sp. 미토콘드리아 genome을 이용하여 맵핑하였다. 갭은 1,789 bp 로, Coverage 는 87.92%로 확인되었다.
D. Transcriptome data 분석
- 애기뿔소똥구리
애기뿔소똥구리의 KOG 결과, “Infomation Storage and Processing” 부분에서는 RNA processing and modification 관련과 translation ribosomal structure 관련이 3.8%로 가장 많이 매칭되고, “Cellular Processes and Signaling” 에서는 signal transduction mechanisms (8.2%), post translational modification (5.0%) 로 많이 매칭된다. “Metabolism” 부분은 평균 1% 대로 낮게 매칭되고, Multiple Function 은 20.3% 이다.
애기뿔소똥구리의 GO 결과, Biological Process에서 cell (1,445개), cell part (1,409개) 순으로 많이 매칭된다. Molecular Function 에서는 binding (2,431개), catalytic activity (2,073개) 순으로 가장 많이 매칭된다. 또한, Cellular Component 부분에서는 cellular process (2,162개), metabolic process (2,061개), single-organism process (1,239개) 순으로 많이 매칭된다.
(4) Microsatellite 후보군
A. SSR statistics
|
애기뿔소똥구리 |
||||||||||||
|
Repeats |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
9 |
10 |
11 |
12 |
13 |
… |
Total |
|
Di |
0 |
0 |
357 |
201 |
65 |
43 |
36 |
8 |
9 |
0 |
|
728 |
|
Tri |
0 |
427 |
64 |
2 |
1 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
|
494 |
|
Tetra |
111 |
3 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
|
114 |
|
Penta |
6 |
0 |
4 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
|
10 |
|
Hexa |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
1 |
0 |
0 |
0 |
|
1 |
|
Total |
117 |
430 |
425 |
203 |
66 |
43 |
37 |
8 |
9 |
0 |
|
1,347 |
→ SSR 검색결과 총 1,347개의 SSR 서열을 확인할 수 있었으며, Di motif 가 728개로 가장 많이 존재하는 것을 확인 할 수 있었으며, 이를 기반으로 하여 SSR marker 후보군에 대한 primer 를 2,306개를 디자인 하였다.
B. Primer sequence
→ 각 종의 유전자를 분석하여 그 종을 구별할 수 있는 primer를 만든다. primer 의 조건은 Motif 약 4~6개이며, Forward 와 Reverse primer 가 18~22개 정도이고 Tm값이 54.5~55.5 정도가 적당하다.
- 애기뿔소똥구리
|
Sequence |
Motif |
Forward Primer |
Tm |
|
Reverse Primer |
|||
|
Ct_Uni_00177 |
(AAG)6 |
AAGAGCTAAATGGCTCAAAAG |
55.69 |
|
TACCGGAACTGTATAACCTGA |
54.88 |
||
|
Ct_Uni_00178 |
(AAG)6 |
AAGAGCTAAATGGCTCAAAAG |
55.69 |
|
TACCGGAACTGTATAACCTGA |
54.88 |
||
|
Ct_Uni_00389 |
(TTC)6 |
TCTAAATTATCGGCCATTGT |
54.87 |
|
ATCCCAAATCACAATCCTAGT |
55.11 |
||
|
Ct_Uni_00389 |
(CTT)6 |
TACCGGAACTGTATAACCTGA |
54.88 |
|
AATTTTTGACCTGTGTCTGG |
55.12 |
||
|
Ct_Uni_00593 |
(TA)12 |
TTGTCTCTTTTGTTAGATTGTCA |
54.41 |
|
GAACTGTATTCAACAGCATCG |
55.92 |
||
|
Ct_Uni_00819 |
(CA)10 |
GAAAAGAGTGATGTGGATGAA |
55.18 |
|
TTTTACCATTGTAGGTGCTTG |
55.52 |
||
|
Ct_Uni_01414 |
(GTACC)6 |
CGGCGGTACATAATAAAAATA |
54.76 |
|
TGTACACCAGTCACACATCTC |
54.25 |
||
|
Ct_Uni_01415 |
(GTACG)6 |
TGTACACCAGTCACACATCTC |
54.25 |
|
CGGCGGTACATAATAAAAATA |
54.76 |
||
|
Ct_Uni_04355 |
(GT)11 |
AACGTAAACTGCATATAATACGA |
53.73 |
|
CTCAGCCAAAAATTAAACAAG |
54.53 |
||
|
Ct_Uni_04355 |
(CA)11 |
CTCAGCCAAAAATTAAACAAG |
54.53 |
|
AACGTAAACTGCATATAATACGA |
53.73 |
||
|
Ct_Uni_04355 |
(GT)10 |
AACGTAAACTGCATATAATACGA |
53.73 |
|
AGGCTTCATAGTCAGTGATCTT |
54.82 |
||
|
Ct_Uni_04356 |
(GT)11 |
AACGTAAACTGCATATAATACGA |
53.73 |
|
CTCAGCCAAAAATTAAACAAG |
54.53 |
||
|
Ct_Uni_06445 |
(TAACC)4 |
CTTAGGTGTGAGCCACAATAG |
55.1 |
|
ATTTGCCTCTATTCATGACCT |
55.42 |
||
|
Ct_Uni_06445 |
(TAACC)4 |
CTTAGGTGTGAGCCACAATAG |
55.1 |
|
ATTTGCCTCTATTCATGACCT |
55.42 |
||
|
Ct_Uni_18486 |
(AT)10 |
CGCTACCCATTTTATTTTTAG |
53.76 |
|
AATGTGAGAACGAGTTCAAAA |
55.02 |
||
|
Ct_Uni_18576 |
(AT)10 |
CGCTACCCATTTTATTTTTAG |
53.76 |
|
AATGTGAGAACGAGTTCAAAA |
55.02 |
C. 바코드 서열
올해 17년도에 채집한 6종의 유전자를 분석하여 그 종을 구별할 수 있는 Barcode 서열을 만들었고, 그 Barcode 서열을 가지고 NCBI (National Center for Biotechnology Information) 사이트에 있는 BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)을 이용하여 결과를 확인하였다. 각 종의 서열들의 BLAST 결과 마커로서 주로 사용되는 COI 서열과 매치되는 것으로 보아 바코드 서열로 사용가능할 것으로 사료된다.
(5) Gene prediction
|
샘플종 |
Number of Contig (>1kb) |
Number of Bases (>1kb) |
N50 Contig Size |
Number of gene prediction |
|
애기뿔소똥구리 |
15,129 |
39,466,368 |
2,667 |
8,069 |
각종별로 transcriptome 서열을 대상으로 1kb 이상만을 선택하여 Gene predcition 한 결과 위의 매칭된 contig, base 수는 위의 표와 같고 N50되는 Contig의 길이도 보통 1~3kb 정도로 나타났다. 그리고 이들을 통해 예측된 유전자의 수는 8천개에서 4만개 이상으로 다양하게 예측되었다.
※ Long contig의 Gene prediction 결과 그림 예시
