비단벌레 (Chrysochroa coreana (fulgidissima))

▣ 국    명 : 비단벌레

▣ 학    명 : Chrysochroa coreana Han & Park, 2012

▣ 지정번호 : 멸종위기 야생생물 Ⅱ급

 ▣ 계    통 : 절지동물문 > 곤충강 > 딱정벌레목 > 비단벌레과
> 비단벌레속

◎ 형 태 : 몸길이는 3~4 cm 정도이며, 몸 빛깔은 녹색 또는 금색을 띤 녹색이며 광택이 있다. 구릿빛을 띤 자색의 굵은 세로띠가 앞가슴등판과 앞날개에 있다. 몸의 배면은 금색을 띤 녹색이고, 가슴과 배의 중앙부는 금색을 띤 적색이며 매우 화려하다. 암컷과 수컷은 비슷한 형태로 수컷은 겹눈이 튀어 나오고 배 끝이 삼각형으로 패어 있으며, 연한 털이 몸 양쪽에 암컷보다 많이 나 있다.


◎ 생 태 : 비단벌레는 울창한 삼림 지대에 서식한다. 떡갈나무·팽나무·벚나무·느티나무 등 오래된 나뭇가지 끝의 주위를 날아다닌다. 특히 나무 위로 높이 날아다니며 화려한 색깔과 무늬가 빛에 반사되면서 반짝거리는 시각적인 신호로 짝을 찾으며, 짝짓기를 마친 암컷은 애벌레의 먹이가 되는 벚나무, 느티나무, 팽나무 등의 껍질 틈에 알을 낳는다.


◎ 분 포 : 국내에는 전라남북도 해안가 국외에는 일본·중국·대만·인도차이나 반도 등지



① 채집정보

- 채 집 자: 빛고을생태연구소 정헌천

- 채집지역: 전라남도 해남군 삼산면 구림리 산 19-1


  그림입니다. 원본 그림의 이름: DSC_0023.jpg 원본 그림의 크기: 가로 2675pixel, 세로 1856pixel 사진 찍은 날짜: 2016년 08월 07일 오후 4:21 카메라 제조 업체 : NIKON CORPORATION 카메라 모델 : NIKON D2Xs 프로그램 이름 : Ver.1.00 F-스톱 : 5.6 노출 시간 : 10/130초 IOS 감도 : 100 색 대표 : sRGB 노출 모드 : 수동 화이트 밸런스 : 자동

◆  포획성충1 : 느티나무잎에서 휴식

 

 그림입니다. 원본 그림의 이름: DSC_0080.JPG 원본 그림의 크기: 가로 3216pixel, 세로 2136pixel 사진 찍은 날짜: 2016년 08월 07일 오후 3:12 카메라 제조 업체 : NIKON CORPORATION 카메라 모델 : NIKON D2Xs 프로그램 이름 : Ver.1.00 F-스톱 : 4.8 노출 시간 : 10/900초 IOS 감도 : 100 색 대표 : sRGB 노출 모드 : 자동 화이트 밸런스 : 자동

◆  포획성충2 : 팽나무잎에서 휴식

   


 그림입니다. 원본 그림의 이름: 20160708_184308.jpg 원본 그림의 크기: 가로 4128pixel, 세로 3096pixel 사진 찍은 날짜: 2016년 08월 07일 오후 6:43 카메라 제조 업체 : SAMSUNG 카메라 모델 : SHV-E330S 프로그램 이름 : E330SKSUDOL4 F-스톱 : 2.2 노출 시간 : 1/1316초 IOS 감도 : 50 색 대표 : sRGB 노출 모드 : 자동 35mm 초점 거리 : 31

◆포획한 성충 2개체


② 채집현황 및 샘플처리

비단벌레 채집현황

샘플처리

채집일

개체 수

DNAseq

RNAseq

표본

2016.08.03

2 EA

1 EA

1 EA

-


③ 기존 NCBI Taxonomy 유전정보 현황

유전정보 종류

Chrysochroa 속 유전자원

Chrysochroa fulgidissima 유전자원 

Nucleotide

137

38

Protein

95

44

Genome

1

1

Gene

13

13


④ Sequencing 결과

비단벌레

Type

Total Reads

Total Bases

Total Bases (Gb)

GC Rate

비고

DNA seq

325,961,430 

49,220,175,930 

49.2 

37.8 

 

RNA seq

58,825,814 

8,882,697,914 

8.9 

38.2 

 


 - Illumina DNA Sequncing 결과

SOAP de novo

CC-DNA hiseq

Input information

　

　

　

Region1

Region2

Total

raw data

Number Of Reads

 

 

162,980,715

162,980,715

325,961,430

Number Of Bases

 

 

24,610,087,965

24,610,087,965

49,220,175,930

error correction

Number Of Reads

 

 

162,483,217

159,186,968

321,670,185

Number Of Bases

 

 

24,228,110,547

23,100,436,381

47,328,546,928

pair reads

Number Of Reads

 

 

 

317,876,854

317,876,854

Number Of Bases

 

 

 

46,803,883,411

46,803,883,411

single reads

Number Of Reads

 

 

 

3,793,331

3,793,331

Number Of Bases

 

 

 

524,663,517

524,663,517

Assembly Results

Scaffold Metrics

> 1 bp*

> 100 bp

> 500 bp**

> 1000 bp

> 2000 bp

Number Of Scaffolds

 

1,783,108

363,677

191,045

95,568

Number Of Bases

 

971,488,915

705,095,978

584,974,089

451,576,767

Avg. Scaffold Size

 

544

1,938

3,061

4,725

N50 Scaffold Size

 

1,690

3,181

4,122

5,440

N80 Scaffold Size

 

317

1,121

1,847

3,057

N90 Scaffold Size

 

157

755

1,371

2,485

largest Scaffold Size

 

47,209

47,209

47,209

47,209

Contig Metrics

> 1 bp*

> 100 bp

> 500 bp**

> 1000 bp

> 2000 bp

Number Of Contigs

36,102,776

3,391,809

301,263

114,746

24,916

Number Of Bases

2,281,180,119

841,230,054

324,018,554

193,744,414

71,970,042

Avg. Contig Size

63

248

1,075

1,688

2,888

N50 Contig Size

67

298

1,172

1,686

2,788

N80 Contig Size

35

134

715

1,215

2,246

N90 Contig Size

34

114

599

1,101

2,116

Largest Contig Size

32,562

32,562

32,562

32,562

32,562

 - Illumina RNA Sequncing 결과

Total number of raw reads

- Number of sequences

58,825,814

- Number of bases

8,882,697,914

Contig information

- Total number of  contig

82,651

- Number of bases

51,199,887

- Mean length of contig (bp)

619.4

- N50 length of contig (bp)

850

- GC % of contig

37.23

- Largest contig (bp)

6,779

- No. of large contigs (≥500bp)

35,568

Unigene information

- Total number of  unigenes

21,797

- Number of bases

20,175,251

- Mean length of unigene (bp)

925.5

- N50 length of unigene (bp)

1,200

- GC % of unigene

37.21

- Length ranges (bp)

224 – 8,435

2) 현재 상황에 대한 고찰

나) 자생 동물자원 Genome Survey

(1) 고품질 genomic DNA 채취 및 표본확보

- 검수용 DNA는 대부분 만족하였고 멸종위기종인 대상종들은 채집량의 제한으로 인해 확증표본으로 제출가능한 표본을 확보하지 못하여 사진으로 대처하고자 함.


검수용  샘플 DNA 농도 및 총 양, 확증표본 현황표

Sample 명

농도(ng/ul)

Volume(ul)

DNA 총량(ug)

저장장소

확증표본

비단벌레

86.629

236

20.444

1XTE pH8.0

사진으로대체


(2) 기타분석

A. Genome Size estimation – Jellyfish 프로그램


각 대상종을 대상으로 Jellyfish 프로그램으로 Genome size를 예측한 결과는 아래와 같다. 각 분석은 k-mer 값 17mer, 19mer, 21mer를 대상으로 하였고 그것을 통해 예측된 genome의 크기는 Estimation genome size 에 표시되었고, 이를 통해 이번 사업에서 분석한 서열의 양의 coverage는 Genome coverage depth(Coverage Depth)에 표기되었다. 그리고 각 종의 표 아래 그래프는 kmer값 별로 나타난 depth의 예측 그래프로 peak값을 확인할 수 있다.


그림입니다. 원본 그림의 이름: CLP000012080013.bmp 원본 그림의 크기: 가로 908pixel, 세로 591pixel







B. 반복서열

-  시퀀싱이 완료된 샘플 DNA 의 contigs 중 1kb 이상의 contigs의 반복서열을 탐색 (Repeat masking results of DNA contigs)



비단벌레(Chrysochroa coreana)

　

비단벌레 (Chrysochroa coreana) 는 1kb 이상의 contig 의 반복서열은 114,746개 read (193,744,414 bp) 이고, GC level 은 36.07% 이다. Repeat Masking 으로 나온 반복서열은 465,929 bp (전체의 0.24%) 만큼 있다. Small RNA 은 607개 read (55,313 bp) 이 있다.

sequences: 114,746

　

total length: 193,744,414 bp (193,744,414 bp excl N/X-runs)

　

GC level : 36.07%

　

bases masked: 465,929 bp ( 0.24%)

　

　

number of

elements

length

occupied

percentage

of sequence

 

SINEs: 

148

9,230 bp

0.00%

 

　

ALUs 

0

0 bp

0.00%

 

　

MIRs 

6

329 bp

0.00%

 

LINEs: 

223

18,033 bp

0.01%

 

　

LINE1 

22

1,214 bp

0.00%

 

　

LINE2 

39

2,179 bp

0.00%

 

　

L3/CR1 

69

4,948 bp

0.00%

 

LTRelements: 

46

3,047 bp

0.00%

 

　

ERVL 

11

654 bp

0.00%

 

　

ERVL-MaLRs

1

57 bp

0.00%

 

　

ERV_classI 

18

1,268 bp

0.00%

 

　

ERV_classII

3

207 bp

0.00%

 

DNAelements: 

1,844

377,432 bp

0.19%

 

　

hAT-Charlie 

110

10,496 bp

0.01%

 

　

TcMar-Tigger

123

16,213 bp

0.01%

 

Unclassified: 

8

559 bp

0.00%

 

Total interspersed repeats:

　

408,301 bp

0.21%

 

Small RNA:

607

55,313 bp

0.03%

 

Satellites:

36

2,365 bp

0.00%

 

 



C. Mito-genome Map

그림입니다. 원본 그림의 이름: 2016_Mito_mapping-비단벌레.jpg 원본 그림의 크기: 가로 3792pixel, 세로 1192pixel 사진 찍은 날짜: 2016년 11월 27일 오후 2:08 프로그램 이름 : Adobe Photoshop CC (Windows) 색 대표 : sRGB

비단벌레는 Reference로 15,592 bp 크기의 Chrysochroa fulgidissima 미토콘드리아 genome을 이용하여 맵핑하였다. 갭은 71 bp 가 나왔고, Coverage 는 99.5%로 확인되었다.

 

D. Transcriptome data 분석

-  비단벌레

그림입니다. 원본 그림의 이름: CLP000012080020.bmp 원본 그림의 크기: 가로 922pixel, 세로 578pixel


비단벌레의 KOG 결과, “Infomation Storage and Processing” 부분에서 replication/recombination/repair (3.8%) 가 가장 많이 매칭되며, “Cellular Processes and Signaling” 에서는 signal transduction mechanisms (4.3%), post translational modification (3.6%), cytoskeleton (3.5%) 등이 많이 매칭된다. 또한 Metabolism 부분에서 carbohydrate transport and metabolism (2.3 %) 가 가장 많이 매칭되고, Multiple Function 은 19 % 이다.

그림입니다. 원본 그림의 이름: GO_정리본-비단벌레.jpg 원본 그림의 크기: 가로 4409pixel, 세로 2931pixel 사진 찍은 날짜: 2016년 11월 27일 오후 10:26 프로그램 이름 : Adobe Photoshop CC (Windows) 색 대표 : sRGB


비단벌레의 GO 결과, Biological Process에서 metabolic process (3,178개), cellular process (3,148개) 순으로 많이 매칭된다. Molecular Function 에서는 binding (2,997개), catalytic activity (2,973개) 순으로 가장 많이 매칭된다. 또한, Cellular Component 부분에서는 membrane (2,213개), cell (1,874개), cell part (1,840개) 순으로 많이 매칭된다.

(4) Microsatellite 후보군

A. SSR statistics

비단벌레

Repeats

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

Di

0

0

2609

2264

2050

1770

1785

3152

5363

1918

207

Tri

0

1686

580

335

294

349

40

2

0

0

0

Tetra

1597

413

148

100

11

0

0

0

0

0

0

Penta

277

65

22

0

0

0

0

0

0

0

0

Hexa

37

10

0

0

0

0

0

0

0

0

0

Total

1911

2174

3359

2699

2355

2119

1825

3154

5363

1918

207


→ SSR 검색결과 총 27,084개의 SSR 서열을 확인할 수 있었으며, Di motif 가 21,118개로 가장 많이 존재하는 것을 확인 할 수 있었으며, 이를 기반으로 하여 SSR marker 후보군에 대한 primer 를 1,044개 디자인 하였다.



B. Primer sequence

→ 각 종의 유전자를 분석하여 그 종을 구별할 수 있는 primer를 만든다. primer 의 조건은 Motif 약 4~6개이며, Forward 와 Reverse primer 가 18~22개 정도이고 Tm값이 54.5~55.5 정도가 적당하다.


- 비단벌레

Sequence

Motif

Forward Primer

Tm

Reverse Primer

71976454

(TAAA)6

ATGAAATCTTTACACCTCACG

54.41

CGAAGTATGGAGGAACAGAAT

55.91

71977840

(ACAA)6

CAACCGTTAGACGCTAGAATA

54.97

GAGCCCCTTTAATGAAACTAA

55.33

72009196

(AAAT)6

ACGGTAGAAAGGCATAAGATT

54.81

GCGGACTTCACTAACAATACA

55.51

72011354

(TTTAA)5

ATGTGCTGTTGACCAATGTA

54.87

CATTCGCATTGAAAGATTCTA

55.65

72040528

(TTTA)4

TTTCTTGATTTCAGTTGGTTC

54.5

TCTCAATAATCATCGAGGAAG

54.54

72040862

(AATA)5

ATCGAGTAACACGCTTAACAG

54.86

TATATTTCATGGCATCCTTTG

55.3

72073202

(ATTT)5

TACGTAACATTTGGAAAAACC

54.48

GTATTGTATTTTTCATTGGAGGT

54.19

72077006

(TGAAC)5

TTTATGGCAATTGTGTTTTG

54.74

TATTACGGAAGTTTTTGTGGA

55.02

72099550

(TACA)4

CAAAGATGGAAGAAATTTGG

54.87

AAGCATTTTAGCGGGTATAGT

55.02

72128528

(ACTATT)4

ATTGCTTGCACTATTGCTATT

54.49

AGCGTATGATAACCGTGAGTA

55.06

72154646

(TTTA)6

CGACAAAAAGGTTAAACTGAG

54.42

GTGAAACTTTACCAAATGCAC

54.9

72155614

(ACCTA)5

CACTCTAAAATTCGCCTACAA

54.93

GAGCTTTCATAAAATTCATCG

54.35

72174704

(TTAC)5

TGCATGGCGATAGTTTATATT

55.09

AGCCGAAACACATGTAGAGTA

55.09

72195672

(AATAT)5

CATAAAACATTCCAAGGATCA

55.17

TCGTGGGATTGATATGTATGT

55.31

 

C. 바코드 서열


    요번 16년도에 채집한 11종의 유전자를 분석하여 그 종을 구별할 수 있는 Barcode 서열을 만들었고, 그 Barcode 서열을 가지고 NCBI (National Center for Biotechnology Information) 사이트에 있는 BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)을 이용하여 결과를 확인하였다. 각 종의 서열들의 BLAST 결과 마커로서 주로 사용되는 COI 서열과 매치되는 것으로 보아 바코드 서열로 사용가능할 것으로 사료된다.



그림입니다. 원본 그림의 이름: CLP000012080002.bmp 원본 그림의 크기: 가로 934pixel, 세로 664pixel

(5) QC 결과

DNA Library QC

Name

Concentration 

 (ng/ul)

Volume

(ul)

Quantity 

(ug)

Main peak Size (bp)

Result

비단벌레

70.35

3.27

230.27

470

pass


RNA Library QC

Name

Concentration 

 (ng/ul)

Volume

(ul)

Quantity 

(ng)

Main peak Size (bp)

Result

비단벌레

57.42

5.74

329.64

268

Pass


(6) Gene prediction

샘플종

Number of  Contig (>1kb)

Number of Bases (>1kb)

N50 Contig Size

Number of gene prediction

비단벌레

114,746

193,744,414

1,686

56,311


각종별로 transcriptome 서열을 대상으로 1kb 이상만을 선택하여 Gene predcition 한 결과 위의 매칭된 contig, base 수는 위의 표와 같고 N50되는 Contig의 길이도 보통 1~3kb 정도로 나타났다. 그리고 이들을 통해 예측된 유전자의 수는 2천개에서 10만개 이상으로 다양하게 예측되었다.


※ Long contig의 Gene prediction 결과 그림 예시

그림입니다. 원본 그림의 이름: CLP000068380005.bmp 원본 그림의 크기: 가로 952pixel, 세로 583pixel