개야길앞잡이 (Callytron brevipilosa)
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▣ 국 명 : 개야길앞잡이 ▣ 학 명 : Callytron brevipilosa (W. Horn, 1908) ▣ 지정번호 : 멸종위기 야생생물 관찰종 ▣ 계 통 : 절지동물문 > 곤충강 > 딱정벌레목 > 길앞잡이과 |
◎ 형 태 : 몸길이는 10~16 mm 내외이며 수컷보다 암컷이 약간 크다. 몸은 청색을 띤 흑색이고 놋쇠의 광택이 난다. 몸의 복면과 가슴 측면은 청남색의 금속광택이 난다. 암컷의 윗입술은 청남색이고 수컷은 담황색으로 암수 간에 차이가 있다. 윗입술의 앞가장자리 중앙부에는 3개의 돌기가 나 있는데 가운데 돌기가 크게 돌출하여 있다. 앞가슴등판은 미세한 털이 전체적으로 산재되어 있으며 딱지날개에는 미세 털이 밀집하여 있다. 딱지날개는 양쪽이 평행하고 뒤는 약간 둥글며 무늬가 없다. 전면에 적동색 바탕에 금록색의 점각이 밀집한다. 몸의 복면, 다리, 촉각의 기부 4마디는 청록색의 금속광택이 난다.
◎ 생 태 : 하천의 모래나 일부 해안사구에서 살며 육식성의 먹이습성을 지닌다. 하천의 모래채취나 하천정비로 모래사구의 서식처가 파괴되면서 개체군이나 개체수가 감소하고 있는 실정이며, 하천의 환경지표종으로의 활용가치가 높다.
◎ 분 포 : 국내에 경기, 충북, 전북지역에 분포하며, 국외로는 한국과 중국에 등지에 분포한다.
① 채집 정보
- 채 집 자: 빛고을생태연구소 정헌천
- 채집지역: 경기도 여주시 점동면 장안리 남한강지류 청미천
◆ 개야길앞잡이성충 생태사진
◆ 포획던 개야길앞잡이 성충 16개체
② 채집현황 및 샘플처리
|
개야길앞잡이 채집현황 |
샘플처리 |
|||
|
채집일 |
개체 수 |
DNAseq |
RNAseq |
표본 |
|
2016.06.08 |
16 EA |
7 EA |
7 EA |
2 EA |
③ 기존 NCBI Taxonomy 유전정보 현황
|
유전정보 종류 |
Callytron 속 유전자원 |
Callytron brevipilosa 유전자원 |
|
Nucleotide |
16 |
- |
|
Protein |
13 |
- |
④ Sequencing 결과
|
개야길앞잡이 |
|||||
|
Type |
Total Reads |
Total Bases |
Total Bases (Gb) |
GC Rate |
비고 |
|
DNA seq |
243,616,852 |
36,786,144,652 |
36.8 |
32.6 |
|
|
RNA seq |
68,400,532 |
10,328,480,332 |
10.3 |
41.4 |
|
- Illumina DNA Sequncing 결과
|
SOAP de novo |
|||||
|
CB-DNA hiseq |
|||||
|
Input information |
|||||
|
|
|
|
Region1 |
Region2 |
Total |
|
raw data |
|||||
|
Number Of Reads |
|
|
121,808,426 |
121,808,426 |
243,616,852 |
|
Number Of Bases |
|
|
18,393,072,326 |
18,393,072,326 |
36,786,144,652 |
|
error correction |
|||||
|
Number Of Reads |
|
|
121,429,753 |
118,258,088 |
239,687,841 |
|
Number Of Bases |
|
|
18,137,561,771 |
17,151,855,237 |
35,289,417,008 |
|
pair reads |
|||||
|
Number Of Reads |
|
|
|
236,203,222 |
236,203,222 |
|
Number Of Bases |
|
|
|
34,796,188,578 |
34,796,188,578 |
|
single reads |
|||||
|
Number Of Reads |
|
|
|
3,484,619 |
3,484,619 |
|
Number Of Bases |
|
|
|
493,228,430 |
493,228,430 |
|
Assembly Results |
|||||
|
Scaffold Metrics |
> 1 bp* |
> 100 bp |
> 500 bp** |
> 1000 bp |
> 2000 bp |
|
Number Of Scaffolds |
|
323,946 |
137,377 |
110,398 |
80,979 |
|
Number Of Bases |
|
573,869,069 |
540,381,722 |
520,969,746 |
478,172,547 |
|
Avg. Scaffold Size |
|
1,771 |
3,933 |
4,719 |
5,904 |
|
N50 Scaffold Size |
|
6,011 |
6,419 |
6,659 |
7,209 |
|
N80 Scaffold Size |
|
2,403 |
2,946 |
3,258 |
3,936 |
|
N90 Scaffold Size |
|
1,113 |
1,820 |
2,198 |
2,988 |
|
largest Scaffold Size |
|
181,870 |
181,870 |
181,870 |
181,870 |
|
Contig Metrics |
> 1 bp* |
> 100 bp |
> 500 bp** |
> 1000 bp |
> 2000 bp |
|
Number Of Contigs |
8,464,211 |
1,175,133 |
306,173 |
144,474 |
39,092 |
|
Number Of Bases |
871,105,466 |
549,047,416 |
377,780,651 |
262,376,989 |
117,381,785 |
|
Avg. Contig Size |
102 |
467 |
1,233 |
1,816 |
3,002 |
|
N50 Contig Size |
294 |
942 |
1,405 |
1,857 |
2,928 |
|
N80 Contig Size |
42 |
283 |
817 |
1,276 |
2,291 |
|
N90 Contig Size |
35 |
160 |
654 |
1,130 |
2,134 |
|
Largest Contig Size |
78,308 |
78,308 |
78,308 |
78,308 |
78,308 |
- Illumina RNA Sequncing 결과
|
Total number of raw reads |
|
|
- Number of sequences |
68,400,532 |
|
- Number of bases |
10,049,510,852 |
|
Contig information |
|
|
- Total number of contig |
152,059 |
|
- Number of bases |
151,666,525 |
|
- Mean length of contig (bp) |
997.4 |
|
- N50 length of contig (bp) |
1,896 |
|
- GC % of contig |
37.88 |
|
- Largest contig (bp) |
33,847 |
|
- No. of large contigs (≥500bp) |
72,918 |
|
Unigene information |
|
|
- Total number of unigenes |
152,059 |
|
- Number of bases |
151,666,525 |
|
- Mean length of unigene (bp) |
997.4 |
|
- N50 length of unigene (bp) |
1,896 |
|
- GC % of unigene |
37.88 |
|
- Length ranges (bp) |
33,847 |
2) 현재 상황에 대한 고찰
나) 자생 동물자원 Genome Survey
(1) 고품질 genomic DNA 채취 및 표본확보
- 검수용 DNA는 대부분 만족하였고 멸종위기종인 대상종들은 채집량의 제한으로 인해 확증표본으로 제출가능한 표본을 확보하지 못하여 사진으로 대처하고자 함.
|
검수용 샘플 DNA 농도 및 총 양, 확증표본 현황표 |
|||||
|
Sample 명 |
농도(ng/ul) |
Volume(ul) |
DNA 총량(ug) |
저장장소 |
확증표본 |
|
개야길앞잡이 |
200.172 |
66 |
13.211 |
1XTE pH8.0 |
O |
(2) 기타분석
A. Genome Size estimation – Jellyfish 프로그램
각 대상종을 대상으로 Jellyfish 프로그램으로 Genome size를 예측한 결과는 아래와 같다. 각 분석은 k-mer 값 17mer, 19mer, 21mer를 대상으로 하였고 그것을 통해 예측된 genome의 크기는 Estimation genome size 에 표시되었고, 이를 통해 이번 사업에서 분석한 서열의 양의 coverage는 Genome coverage depth(Coverage Depth)에 표기되었다. 그리고 각 종의 표 아래 그래프는 kmer값 별로 나타난 depth의 예측 그래프로 peak값을 확인할 수 있다.
B. 반복서열
- 시퀀싱이 완료된 샘플 DNA 의 contigs 중 1kb 이상의 contigs의 반복서열을 탐색 (Repeat masking results of DNA contigs)
|
개야길앞잡이 (Callytron brevipilosa) |
|
개야길앞잡이 (Callytron brevipilosa) 는 1kb 이상의 contig 의 반복서열은 144,474개 read (262,376,989 bp) 이고, GC level 은 31.41%이다. Repeat Masking 으로 나온 반복서열은 204,831 bp (전체의 0.08%) 만큼 있다. Small RNA 은 227개 read (13,143 bp) 이 있다. |
||||
|
sequences: 144,474 |
|
|||||
|
total length: 262,376,989 bp (262,376,989 bp excl N/X-runs) |
|
|||||
|
GC level : 31.41% |
|
|||||
|
bases masked: 204,831 bp ( 0.08%) |
|
|||||
|
|
number of elements |
length occupied |
percentage of sequence |
|
||
|
|
||||||
|
SINEs: |
18 |
885 bp |
0.00% |
|
||
|
|
ALUs |
0 |
0 bp |
0.00% |
|
|
|
|
MIRs |
3 |
137 bp |
0.00% |
|
|
|
LINEs: |
7 |
4,295 bp |
0.00% |
|
||
|
|
LINE1 |
78 |
652 bp |
0.00% |
|
|
|
|
LINE2 |
12 |
964 bp |
0.00% |
|
|
|
|
L3/CR1 |
18 |
1,686 bp |
0.00% |
|
|
|
LTRelements: |
37 |
2,571 bp |
0.00% |
|
||
|
|
ERVL |
9 |
513 bp |
0.00% |
|
|
|
|
ERVL-MaLRs |
2 |
74 bp |
0.00% |
|
|
|
|
ERV_classI |
20 |
1,281 bp |
0.00% |
|
|
|
|
ERV_classII |
0 |
0 bp |
0.00% |
|
|
|
DNAelements: |
1233 |
180,374 bp |
0.07% |
|
||
|
|
hAT-Charlie |
235 |
21,283 bp |
0.01% |
|
|
|
|
TcMar-Tigger |
100 |
11,843 bp |
0.00% |
|
|
|
Unclassified: |
2 |
200 bp |
0.00% |
|
||
|
Total interspersed repeats: |
|
188,325 bp |
0.07% |
|
||
|
Small RNA: |
227 |
13,143 bp |
0.01% |
|
||
|
Satellites: |
55 |
3,508 bp |
0.00% |
|
||
C. Mito-genome Map
개야길앞잡이는 Reference로 16,462 bp 크기의 Calosoma sp. 미토콘드리아 genome을 이용하여 맵핑하였다. 갭은 152 bp 가 나왔고, Coverage 는 99.1%로 확인되었다.
D. Transcriptome data 분석
- 개야길앞잡이
개야길앞잡이의 KOG 결과, “Infomation Storage and Processing” 부분에서 transcription 이 2.8% 로 가장 많고, reolication/recombination/repair (2.7%)가 가장 많이 매칭된다. “Cellular Processes and Signaling” 에서는 signal transduction mechanisms (6.9%), extracellular structures (4.8%) 등이 많이 매칭된다. 또한 Metabolism 은 1% 대로 낮게 매칭되고, Multiple Function 은 22.7% 이다.
개야길앞잡이의 GO 결과, Biological Process에서 metabolic process (2,710개), cellular process (2,099개) 순으로 많이 매칭된다. Molecular Function 에서는 binding (3,544개), catalytic activity (2,700개) 순으로 가장 많이 매칭된다. 또한, Cellular Component 부분에서는 cell (1,234개), cell part (1,231개), membrane (1,028개) 순으로 많이 매칭된다.
(4) Microsatellite 후보군
A. SSR statistics
|
개야길앞잡이 |
|||||||||||
|
Repeats |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
9 |
10 |
11 |
12 |
13 |
14 |
|
Di |
0 |
0 |
6355 |
4347 |
3579 |
3365 |
6058 |
14436 |
18095 |
4818 |
175 |
|
Tri |
0 |
2635 |
1017 |
430 |
233 |
156 |
60 |
0 |
0 |
0 |
0 |
|
Tetra |
2157 |
449 |
141 |
61 |
8 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
|
Penta |
393 |
87 |
36 |
2 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
|
Hexa |
94 |
50 |
2 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
|
Total |
2644 |
3221 |
7551 |
4840 |
3820 |
3521 |
6118 |
14436 |
18095 |
4818 |
175 |
→ SSR 검색결과 총 69,239개의 SSR 서열을 확인할 수 있었으며, Di motif 가 61,228개로 가장 많이 존재하는 것을 확인 할 수 있었으며, 이를 기반으로 하여 SSR marker 후보군에 대한 primer 를 2,650개 디자인 하였다.
B. Primer sequence
→ 각 종의 유전자를 분석하여 그 종을 구별할 수 있는 primer를 만든다. primer 의 조건은 Motif 약 4~6개이며, Forward 와 Reverse primer 가 18~22개 정도이고 Tm값이 54.5~55.5 정도가 적당하다.
- 개야길앞잡이
|
Sequence |
Motif |
Forward Primer |
Tm |
|
Reverse Primer |
|||
|
16640867 |
(TCACT)5 |
GCTGGAATGTGAGGTAGTACA |
55.34 |
|
GGTAGTAGATCAACGGCACTA |
54.61 |
||
|
16663241 |
(TTGTG)4 |
TTAGTTTTGTGGCTACGTGTT |
55.18 |
|
TCGTCTTGCAAGTCTTAGTTT |
54.54 |
||
|
16687084 |
(TCGCGG)4 |
GTCTTGAAAAGTAGGCCTGTC |
55.69 |
|
GGAAGTGGTTATGGAAGAGAT |
54.82 |
||
|
16709832 |
(TATC)4 |
TTATTACTCTAGCGGTTGTGC |
54.96 |
|
CGACTGCAAATTCAACTTATAC |
54.41 |
||
|
16733874 |
(AAAAGA)4 |
AGTTTAAATTAGGGCACGAAA |
55.8 |
|
TCAATTTTCTTCTCTCTTTCTTC |
54.01 |
||
|
16756462 |
(ATTT)4 |
GCAGTGGCTATTTTAACAGAA |
54.92 |
|
AGCTTGCATATAAGTTCGTTG |
54.96 |
||
|
16778177 |
(ACTGC)4 |
AGAACGATATGAACCAAAAGG |
55.9 |
|
TTGCACGGTTTTCTATTTCTA |
55.33 |
||
|
16799881 |
(TATT)6 |
TATCCGTCGCATAACAAATAA |
55.95 |
|
TGTGGGATTAAGTTGAAACAG |
55.32 |
||
|
16821997 |
(GCCCAG)6 |
CAACAACAACAGCAACAATC |
55.1 |
|
GTATTGCGACTGGGACTG |
54.91 |
||
|
16842341 |
(TAAAA)5 |
CGATTACTTTGTGATGGATGT |
55.1 |
|
AAAAATCTAGGGACATTTTCG |
55.18 |
||
|
16862911 |
(TGAA)6 |
GCATAGAGTGCGTTTTGTTAG |
55.42 |
|
TTTCTGTTTAAGATGCTCCTG |
54.88 |
||
|
16880587 |
(AATA)6 |
TATCCAGACGTGTTTTCAAAG |
55.48 |
|
TGGGTCACTTCAAGAATTATG |
55.24 |
||
|
16899563 |
(AACCA)4 |
ATGAAGCATCCTCCTTTTACT |
54.76 |
|
CTTTCCGTGTCAGTGTATCAT |
55.17 |
||
|
16914947 |
(TATAA)4 |
TTATTTAGGGATTTTCGAGGT |
54.74 |
|
AAAACTGTGGATGTAGGTGTG |
55.08 |
C. 바코드 서열
요번 16년도에 채집한 11종의 유전자를 분석하여 그 종을 구별할 수 있는 Barcode 서열을 만들었고, 그 Barcode 서열을 가지고 NCBI (National Center for Biotechnology Information) 사이트에 있는 BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)을 이용하여 결과를 확인하였다. 각 종의 서열들의 BLAST 결과 마커로서 주로 사용되는 COI 서열과 매치되는 것으로 보아 바코드 서열로 사용가능할 것으로 사료된다.
(5) QC 결과
|
DNA Library QC |
|||||
|
Name |
Concentration (ng/ul) |
Volume (ul) |
Quantity (ug) |
Main peak Size (bp) |
Result |
|
개야길앞잡이 |
41.21 |
3.27 |
134.9 |
470 |
pass |
|
RNA Library QC |
|||||
|
Name |
Concentration (ng/ul) |
Volume (ul) |
Quantity (ng) |
Main peak Size (bp) |
Result |
|
개야길앞잡이 |
76.64 |
5.15 |
394.34 |
299 |
Pass |
(6) Gene prediction
|
샘플종 |
Number of Contig (>1kb) |
Number of Bases (>1kb) |
N50 Contig Size |
Number of gene prediction |
|
개야길앞잡이 |
14,447 |
262,376,989 |
1,857 |
49,027 |
각종별로 transcriptome 서열을 대상으로 1kb 이상만을 선택하여 Gene predcition 한 결과 위의 매칭된 contig, base 수는 위의 표와 같고 N50되는 Contig의 길이도 보통 1~3kb 정도로 나타났다. 그리고 이들을 통해 예측된 유전자의 수는 2천개에서 10만개 이상으로 다양하게 예측되었다.
※ Long contig의 Gene prediction 결과 그림 예시
